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临床微生物学检验技术
细菌检验（形态、培养、鉴定、药敏）
编辑于2020-09-14 21:32:09- 临床微生物学检验技术
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细菌检验
细菌形态学
显微镜
相差显微镜
暗视野显微镜
不染色活细菌
普通光学显微镜
工作距离：油镜头：0.18mm
荧光显微镜
光源：高压汞灯
电子显微镜
透射显微镜（TEM）
扫描显微镜（SEM）
细菌
不染色标本的检查（活体检查法）
主要用于检查动力和运动情况
压滴法（高倍镜下观察）
结果：有鞭毛细菌位移；无鞭毛细菌分子运动
悬滴法
注意：菌液量适量
染色标本的检查
常用染色剂
按来源分
自然染色剂
人工染色剂
按助色基团解离后带电性质分
碱性染料（最常用）：正电荷
常用美兰、结晶紫、碱性复红
酸性染料：负电荷
常用伊红、酸性复红、刚果红
复合染料（中性）
常用伊红亚甲蓝、伊红天青
染色标本检查的基本程序
涂片→干燥→固定→染色→镜检
常用的染色方法
单染法
亚甲蓝染色
复染法 （基本程序：初染→媒染→脱色→复染→ 镜检）
革兰染色：蓝紫；红
蓝紫色，革兰染色＋ 红色，革兰染色－
抗酸染色（萋纳染色）：红；蓝
非抗酸性细菌菌体，蓝色－ 抗酸性细菌菌体，红色＋
5%石碳酸复红初染 3%盐酸酒精脱色 吕氏美蓝复染
荧光染色
负染色法
常用：墨汁染色 新生隐球菌
特殊染色
细菌的特殊结构的染色
鞭毛染色
荚膜染色
细胞壁染色
芽胞染色
异染颗粒染色
白喉棒状杆菌
细菌的培养与分离技术
基本条件
接种针（环）
红外接种环灭菌器
酒精灯
培养皿
培养箱
培养基的种类和选择
培养基的主要成分
营养物质 氮源 碳源 无机盐 生长因子
水分 蒸馏水 离子交换水
凝固物质 琼脂： 98℃以上融化， （最常用）45 ℃以下凝固
抑制剂
指示剂
酸碱指示剂
氧化还原指示剂
美兰氧化时兰色，还原时无色
金属指示剂、吸附指示剂等
培养基的分类
按用途分类
基础培养基
肉汤
普通琼脂平板
营养培养基
血琼脂平板（BA）
各类细菌标本的分离
巧克力色琼脂平板（CA）
嗜血杆菌、奈瑟氏菌的分离
选择培养基
SS琼脂平板 较强抑菌能力
指示剂：中性红
鉴别培养基
糖发酵管
克氏双糖培养基（KIA）
指示剂：酚红
概要
具有选择作用的鉴别培养基： 麦康凯培养基（MAC）：中等强度选择鉴别培养基 伊红美蓝培养基（EMB）、中国蓝培养基（CB）：弱选择鉴别培养基 SS培养基：强选择鉴别培养基
特殊培养基
厌氧（庖肉）培养基 用于培养厌氧菌
L型培养基 高渗低琼脂含血清培养基
按物理性状分类
液体培养基
肉汤培养基
用于增菌和接种纯种细菌
半固体培养基
液体培养基+0.2%～0.5%琼脂
观察细菌的动力，保存菌种
固体培养基
液体培养基+2%～3%琼脂
用于微生物的分离培养、纯培养、鉴 定、药敏、菌种的保存及基础培养基
培养基制备的一般程序
调配 ↓ 溶化 ↓ 矫正pH ↓ 过滤澄清 ↓ 分装 ↓ 灭菌 ↓ 检定 ↓ 保存
细菌的人工培养
无菌技术
一穿三戴，离开时更衣、消毒液泡手
细菌的接种与分离方法
细菌接种的基本程序
灭菌接种环 ↓ 俟冷 ↓ 蘸取标本 ↓ 接种 ↓ 灭菌接种环
接种方法
平板划线法
用于细菌分离培养
分区划线法
分离纯种
连续划线法
大量培养细菌
方格法、方设法、四格法等
琼脂斜面接种法
用于纯培养、保存菌种、观察生化反应
穿刺接种法
用于动力、生化反应和保存菌种
液体培养基接种法
肉汤、蛋白胨水、糖发酵管
需要避免接种环与液体过多接触，更不应该在液体中搅拌，以免形成气溶胶
用接种环从平板上挑取单个菌落，倾斜液体培养管，先在接近液面的试管壁上研磨并蘸取少量液体与之调和——以试管直立后液体淹没培养物为主
倾注平板法
用于活菌计数
涂布接种法
用于细菌药敏、生物制品
细菌的培养方法
普通培养法（需氧培养法）
二氧化碳培养法
脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、布鲁菌
5％-10％的二氧化碳
烛缸法
微需氧培养法
空肠弯曲菌、幽门螺杆菌
5％-6％氧气＋5％－10％二氧化碳＋85％氮气
厌氧培养法
细菌的生长现象
在固体培养基
菌落：单个单一
主要类型
S型菌落（光滑型）
R型菌落（粗糙型）：是S型细菌变异失去菌体表面多糖或者蛋白质形成的
M型菌落（黏液型）
厚荚膜
如：肺炎克雷伯菌
鉴别细菌
①溶血性：α、β、γ ②气味：生姜味；巧克力烧焦味（变形）；腐败的恶臭味（厌氧菌）；酵母味（白假丝酵母）； 泥土味（放线菌） ③色素：脂溶、水溶性色素
菌苔
在液体培养基
混浊生长
大多数细菌
沉淀生长
链球菌；炭疽芽孢杆菌 多是链状排列
表面生长（菌膜）
专性需氧菌（枯草）
在半固体培养基
有鞭毛细菌： 向外扩散生长， 呈羽毛状或者是云雾状
无鞭毛细菌：沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰
细菌的生物化学鉴定技术
碳水化合物代谢试验
糖(苷、醇)类发酵试验
是细菌生化实验中最重要和最基本的实验
肠杆菌科细菌鉴定
指示剂：酚红、溴甲酚紫
结果：产酸，黄色（A）；不产酸，紫色（K）；产气＋；不产气－
葡萄糖氧化发酵试验（O-F试验）
肠杆菌科细菌为发酵型
葡萄球菌：发酵 微球菌属：氧化
培养基：Hugh－leifson培养基（含有酸碱指示剂）
氧化型细菌（O）：有氧环境中分解 发酵型细菌（F）：有氧无氧都能分解 产碱型细菌（－）：有氧无氧都不分解
指示剂：溴麝香草酚蓝 （不能用酒精溶液，因细菌可使酒精产酸，导致假阳性）
β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
具有半乳糖苷渗透酶和β-半乳糖苷酶两种酶的细菌可迅速分解乳糖
七叶苷水解试验
主要用于D群链球菌阳性，其余阴性（粪肠球菌＋）
甲基红（MR）试验
IMViC试验中的M
指示剂：甲基红试剂
培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基
结果：红色＋；黄色－
应用：大肠埃希菌为＋，产气肠杆菌为－
V-P试验
IMViP试验中的Vi
原理：葡萄糖生成丙酮酸，脱氢生成乙酰甲基甲醇，氧化为二乙酰，与胍基结合形成红色化合物
指示剂：V-P试剂甲液、乙液
培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基
结果：红色化合物＋；无红色出现且35℃ 4h后培养基不变色－
蛋白质和氨基酸代谢试验
吲哚实验（靛基质试验）
IMViC试验中的I
原理：色氨酸酶分解色氨酸生成吲哚，与对二甲氨基苯甲醛形成红色的玫瑰吲哚
培养基：蛋白胨水培养基
结果：液面接触处出现红色为＋，无色为阴－
应用：肠杆菌科细菌的鉴定
硫化氢试验
醋酸铅培养基 KIA TSI
原理：含硫氨基酸生成硫化氢，与铅或亚铁离子生成黑色硫化物
培养基：含硫酸亚铁或醋酸铅的培养基
结果：培养基变黑为＋，不变黑为－
应用：沙门菌属、变形杆菌属＋
尿素酶试验（脲酶试验）
原理：尿素酶分解尿素生成氨，呈碱性，酚红指示剂变红
培养基：尿素培养基
结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为＋，不变为－
应用：幽门螺杆菌，普通变形杆菌，奇异变形杆菌＋
苯丙氨酸脱氢酶试验
变形杆菌素，摩根菌属和普罗威登菌属＋
结果：绿色化合物＋
氨基酸脱氢酶试验
赖氨酸脱羧为尸胺 鸟氨酸→腐胺 精氨酸→精胺
结果：紫色＋，黄色－
碳源利用试验
枸橼酸盐利用试验
IMViC试验中的C
原理：铵盐为唯一氮源，以枸橼酸盐为唯一碳源，分解枸橼酸钠生成碳酸钠分解铵盐为氨
指示剂：溴麝香草酚蓝
培养基：枸橼酸盐培养基
结果：培养基变蓝＋，培养基无细菌生长不变色－
应用：用于肠杆菌科中菌属的鉴定。埃希菌属、志贺菌属、耶尔森菌属、爱德华菌属－，枸橼酸杆菌属、沙门菌属、克雷伯菌属＋
马尿酸盐水解试验
丙二酸盐利用试验
醋酸盐利用试验
乙酰胺利用试验
呼吸酶类试验
氧化酶试验
原理：氧化酶能将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺氧化生成红色的醌类化合物
培养基：营养琼脂
方法：菌落法、滤纸法、试剂纸片法
结果：二甲基对苯二胺盐酸盐为红-深红-紫红色，四甲基对苯二胺盐酸盐为蓝色为阳性
应用：肠杆菌科－，假单胞菌＋。铜绿假单胞菌＋，大肠埃希菌－
过氧化氢酶（触酶）试验
原理：过氧化氢酶分解成水和新生态氧，出现气泡
结果：产生大量气泡＋，无气泡－
应用：革兰阳性球菌的初步分群。葡萄球菌属＋，链球菌属－
硝酸盐试验
肠杆菌科均为阳性
硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，生成红色N-α-萘胺偶氮苯磺酸
培养基：硝酸盐培养基
结果：出现红色＋；无颜色反应，加Zn，若变红－；不产生成红色，假阴性＋
应用：肠杆菌科细菌＋→亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、食麦芽窄食单胞菌＋→氮气
其他实验
凝固酶试验
结合凝固酶：玻片法 游离凝固酶：试管法
应用：葡萄球菌致病性的重要指标。葡萄球菌属中只有金黄色葡萄球菌为＋；表皮和腐生葡萄球菌为－
卵磷脂酶试验
形成乳白色浑浊圈
蜡样芽孢杆菌＋
产气荚膜梭菌＋
DNA酶试验
出现透明环
金黄色葡萄球菌＋
胆汁溶菌试验
CAMP试验
CAMP因子，出现箭头型透明溶血区
B群链球菌＋
杆菌肽试验
A群链球菌＋
用去鉴别A群链球菌和其他链球菌
奥普托欣试验
肺炎链球菌＋
用于区别肺炎链球菌和其他链球菌
氢氧化钾拉丝试验
O/129抑菌试验
复合生化试验
克氏双糖铁（KIA）培养试验
结果：发酵乳糖（葡萄糖）：A；不发酵乳糖（葡萄糖）：K 产气泡＋；不产气泡－ 产生H²S形成黑色沉淀物＋；不产生黑色沉淀物－
动力-靛基质-尿素酶（MIU）试验
玫瑰红，靛基质试验＋ 全管变成桃红色，尿素酶试验＋ 羽毛状或云雾状混浊生长，动力＋
细菌耐药性检测
临床常用抗菌药物
β-内酰胺类
青霉素类
头孢菌素类
其他β-内酰胺类
单环类
头霉素类
碳青霉烯类
β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂
氨基糖苷类
大环内酯类
喹诺酮类
糖肽类和环脂肽类
磺胺类和三甲氧苄氨嘧啶
四环素类
霉素类
氯霉素类
抗菌药物敏感试验（AST）
药敏试验的抗菌药物选择
敏感S
中介I
耐药R
稀释法
原理：MH肉汤倍比稀释抗生素，菌液定量0.5麦氏即（1.5）×10ⁿCFU/ml（n=8），1：1000（或1：200）稀释，最终菌液浓度（每管或每孔）为5×10ⁿCFU/ml（n=5），经培养后观察，以抗菌药物最小抑菌浓度（MIC）管，即为试验菌株对药物的敏感度。
操作：
制备培养基（MH）
药物原液
菌液
正式试验
倍比稀释抗生素
定量加菌液
培养
判读结果
结果报告：XXX抗生素的MIC为xxCFU/ml，与临床和实验室标准机构提供的标准比较报告XXX菌对XXX抗生素敏感/耐药/中介。
结果：无菌落生长的最低药物浓度为MIC（仅为单个菌落忽视）
纸片扩散（K-B）法
原理：将含有定量抗菌药物的纸片平贴在以涂布接种测试菌的MH琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散，形成连续的、动态的、递减的梯度浓度，在纸片周围一均浓度范围内测试龟的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌圈。抑菌圈的直径反应测试菌对测定药物的敏感程度。
操作：
制备培养基（M-H）
药物纸片
菌液
正式试验
接种
贴卡片
培养
判读结果、质控
用游标卡尺或直尺量取抑菌圈直径，先量取质控菌株的抑菌环直径，以判断质控是否合格；然后量取试验菌株的抑菌环直径。根据CLSI标准，对量取的玉龟圈直径作出药敏、耐药和中介的判断。
结果：
根据CLST标准XX菌对XXX抗生素敏感/耐药/中介。 XXX抗生素敏感/耐药/中介。
E-test法
浮动主题