食品微生物检验技术

绪论、微生物检验室及配置、食品微生物检验样品的采集、食品微生物检验指标、食品企业卫生微生物检验。

食品微生物检验技术

• 绪论
• 微生物检验室及配置
• 食品微生物检验样品的采集
• 微生物生理生化实验
  • 生理生化试验概述
  • 碳源利用试验
  • 氮源利用试验
  • 酶类试验
  • 其他试验
• 食品微生物检验指标
  • 微生物指标概述
    • 定义
      • 对某个产品或某个批次产品<b>可接受程度</b>的规定。这个规定基于<u>单位质量、单位体积、单位表面积或 每一批次产品中微生物（包括寄生虫）和（或）其代谢产物及毒素检出与否或数量。</u>
    • 食品微生物指标的构成
      • （1）食品微生物指标包括：
        • 对微生物和（或）其所产毒素和代谢产物的说明以及将该种微生物作为指标的依据；
        • 微生物的定性和（或）定量分析方法；
        • 对现场抽样数量和分析单元大小的规定；
        • 与食品链特定环节相适应的微生物限量；
        • 与微生物限量相适应的分析单元的数量。
      • （2）微生物指标应说明：
        • 适用的食品种类；
        • 适用的食品链环节
        • 不符合指标时应采取的措施
    • 食品微生物指标的目的和运用
      • （1）监管部门以及食品行业从业者可以运用微生物指标;确定原材料;、辅料;以及产品;是否可以被接受进入食品链的下一个环节;。
      • 此外,微生物 指标也可被用于确定加工工艺是否符合CAC/RCP 1—2003;的要求。
      • （2）微生物指标通常并不适合;监控GB/T 19538;中提出的关键限值;。
    • 微生物指标中的微生物学要素
      • 食品中的微生物、寄生虫和（或）其所产毒素和代谢产物主要包括：
        • 细菌、病毒、酵母、霉菌和藻类
        • 寄生的原生动物和寄生虫
        • 它们的毒素及代谢产物
      • 微生物指标中涉及的微生物应是被普遍认可的1病原微生物、2指示微生物;和（或）3造成食品腐败变 质的微生物;,对食品的危害尚不确定的微生物不应包含在内。;
      • 应优先考虑用可靠的方法直接检验病原微生物;而不是指示物。如果检验指示物,应明确其目的;。
    • 检验报告
      • 检验报告的内容
        • 完整的样品识别信息
        • 抽样计划
        • 检验方法以及检验结果
        • 必要时应对上述内容给出解释和说明。
  • 菌落总数检验
    • 1 细菌总数
      • 定义：指一定数量或面积的食品样品，经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数;，其中包括各种活菌数;和尚未消失的死菌数;，又称细菌直接显微镜数;。
      • 表示：通常以1g或1m1或1cm2样品中;的细菌总数;来表示
      • 意义：食品中细菌数量越多，则食品腐败变质的速度就越快，甚至可引起食用者的不良反应。
      • 食品中细菌数量达到100-1000万个/g时，就可能引起食用者的食物中毒。
    • 2 菌落总数（杂菌数，需氧菌数）
      • 定义：指一定数量或面积的食品样品，在一定条件（培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等)下进行培养，即使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落;，然后进行菌落计数;所得的菌落数量;。
      • 表示：通常以1g或1ml或1cm2样品中;所含的菌落数量;来表示
      • 菌落形成单位：colony forming unit，CFU
    • 测定方法
      • GB/T 4789.2-2016——标准平板菌落计数法
        • 活菌计数
        • 基本操作包括：样品的稀释;（25+225ml）——10倍梯度稀释匀液;——倾注平皿;（1ml匀液+46℃，PCA，15-20mL）——培养;（（36±1）℃（48±2）h，（30±1）℃（72±3)h）——计数报告;（30-300CFU）。
        • 关键点：1一个菌落代表一个单细胞 2合适的稀释
        • 计数方法
      • ISO4833-1：2013
        • 适用范围
          • 食品与饲料生产操作环境样品检测
          • 低污染样品的菌落总数
          • 低于100/g或100/ml液体样品或1000/g的固体样品。
        • 1样品的处理
          • ①固体和半固体样品：称取1g样品;加人盛有9mL的磷酸盐缓冲液;或生理盐水;的无菌均质杯或均质袋;内，8000-10000r/min离心均质;1-2min，或拍打;1-2min，制成1：10的样品匀液。;
            • 离心均质 均质杯；拍击均质器 均质袋
          • ②液体样品：以无菌吸管;吸取1mL样品;置盛有9mL磷酸盐缓冲液;或生理盐水;的无菌锥形瓶;，瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠;，充分混匀;，制成1：10的样品匀液;。然后做适当的不同10倍稀释。;
        • 2加样
        • 3培养待琼脂凝固;后，将平板翻转;，(30±1)℃;培养（72±3)h;
        • 计数方法
      • FDA：BAM 菌落总数测定流程
        • （1）检样x g或mL加入至9x ml磷酸盐缓冲液;。
        • 2）制成适当十倍梯度稀释;样品。
        • （3）选择2-3个连续适宜稀释度;各取1mL;分别加入灭菌平皿;内，每个稀释度做两个平行;
        • 4）每皿;内加入适量平板计数琼脂;于35 ℃;培养48±2h。;
        • （5）菌落计数
        • 计数方法
  • 大肠菌群检验
    • 概念：大肠菌群系指一群在37℃;能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧;的革兰氏阴性;的无芽胞;杆菌。
      • 大肠菌群并非细菌学分类命名,而是卫生细菌领域的用语,它不代表某一种或某一属的细菌,而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。这一群细菌包括埃希菌属、枸橼酸菌属、肠杆菌属(又叫产气杆菌属,包括阴沟肠杆菌和产气肠杆菌)、克雷伯菌属中的一部分和沙门菌属的第Ⅲ亚属(能发酵乳糖)的细菌。
    • 判定方法：IMViC;试验结果为“++--;”的，通常称为典型大肠杆菌;，而其他则被称为非典型大肠杆菌
    • 测定的意义：是评价食品卫生质量的重要指标之一，可作为肠道致病菌污染食品的指示菌;。
    • 大肠菌群GB 4798.3-2016检验方法
      • 第一法 大肠菌群MPN;计数法
        • 大肠菌群MPN最可能数 most probable number，MPN。
        • 适用范围：适用于大肠杆菌含量较低;的食品中的大肠杆菌计数
        • 实验原理
          • 1ml(或1g);食品检样中所含的大肠菌群的最近似;或最可能数;。
          • MPN是基于泊松分布的一种间接计数方法;，是统计学和微生物学结合的一种定量检测法，即应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值。
          • 待测样品经系列稀释并培养;后,根据其未生长的最低稀释度;与生长的最高稀释度,;应用统计学概率论，推算出待测样品中菌群的最大可能数。
          • 有三管系列;、五管系列;和其它系列;，其原理相同，区别在于样品滴度和各滴度的管数;，三管系列接种三个滴度、每个滴度三管;、五管系列接种五个滴度、每个滴度五管。;
        • 重要仪器、培养基和试剂：
          • 发酵管：180×18mm试管+杜氏小管
          • 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST;）肉汤 pH6.8±0.2;
          • 煌绿乳糖胆盐（BGLB;）肉汤 pH 7.2±0.1;
          • 无菌磷酸盐稀释液、无菌生理盐水、1mol/L盐酸、1mol/L氢氧化钠 ;
            • ，稀释液：调节ph
        • 操作流程：
          • 1 检样稀释(样品匀液 pH 值应在 6.5～7.5 ;之间)
          • 2 初发酵试验（LST;肉汤，每管接种1mL;，如接种量超过1 mL;，则用双料LST肉汤，36℃±1 ℃;培养24 h±2 h;）
          • 3 复发酵试验（分别取1环LST肉汤;培养物移种BGLB;肉汤管中，36 ℃±1℃;培养48 h±2 h;）
            • 按复发酵试验中确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。
          • 4 报告
      • 第二法 大肠菌群平板;计数法
        • 适用范围 ：本检验方法平板计数法适用于大肠菌群污染较高;的食品。然而具体使用哪种方法主要依据检验目的和食品安全相关标准的规定。
        • 实验原理
          • 大肠菌群在固体培养基;中发酵乳糖产酸;，在指示剂;的作用下形成可计数的红色或紫色;，带有或不带有沉淀环;的菌落。
        • 培养基
          • 典型菌落为紫红色;,菌落周围有红色的胆盐沉淀环;,菌落直径为0.5mm;或更大
        • 操作流程
          • 样品的稀释
          • 倾注（VRBA，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h）
          • 平板菌落数的选择
            • （选取菌落数在15CFU~150CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和菌落直径较典型菌落小的可疑大肠菌群菌落）
          • 证实试验
            • 从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃培养 24 h～48 h，观察产气情况
          • 大肠菌群平板计数的报告
            • 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数，最低稀释度平板低于15CFU 的记录具体菌落数。
    • 质控
      • 1）实验过程中，每批样品稀释液都要做空白对照;。
      • 2）为了控制环境污染,在毎次检验过程中,于检验工作合上打开两块计数凉脂平板;,并在检验环境中暴属不少于15分钟;、将此平板与本批次样品同时进行培养;,以掌握检验过程中是香存在来自检验环境的污橤。
      • （3）定期使用大肠埃希菌ATOC25922或相应定量活菌参考品,在P2实验室或阳性对照实验室内用适当的食品样品进行阳性对照;实验验证,并进行记录。此验证实验至少每2个月;进行一次
    • 注意事项：
      • （1）大肠菌群的检验步骤采用初发酵实验和复发酵实验。如只作一步发酵，对某些食品来说，误差较大，会有相当部分的合格样品被作为不合格处理，应予以注意。
      • （2）大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。
      • （3）大肠菌群是一群肠道杆菌的总称。其色泽、形态等方面复杂和多样，应熟悉大肠菌群的菌落色泽和形态。
      • （4）在发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。
      • （5）注意双料管的配制及适用
      • （6）MPN是样品中活菌密度的估测。MPN检索表是采用3个稀释度9管法，稀释度的选择是基于对样品中菌数的估测，较理想的结果是最低稀释度3管为阳性，而最高稀释度3管为阴性。若无法估测样品中的菌数，则应做一定范围的稀释度。表为95％可信限的MPN检索表。
      • （7）试验从样品制备到检测完毕不超过30min。
  • 沙门氏菌的检验
    • 定义及生物学特性
      • 定义
        • 沙门氏菌属（Salmonella）是一大群寄生于人类和动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌，统称为沙门氏杆菌。属肠杆菌科,革兰阴性无芽孢杆菌,典型菌株多具有周生鞭毛、能运动、能分解葡萄糖并产气。
        • 两个组成
          • 子主题
      • 生物特性
    • 检验方法
    • 质控
    • 注意事项
  • 金黄色葡萄球菌的检验
  • 霉菌和酵母菌的计数
• 食品企业卫生微生物检验