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蛋白质的理化性质分类及研究方法知识点总结
蛋白质的理化性质、分类及研究方法知识点总结：蛋白质纯化的准备工作：明确纯化蛋白质的目的、建立蛋白质活性测定的方法、选择含有目标蛋白的原材料。
编辑于2022-05-03 14:56:16- 研究方法
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蛋白质的理化性质、分类及研究方法知识点总结
蛋白质的理化性质
紫外吸收
苯环氨基酸
Phe, Tyr, Trp
吸收峰
280nm
吸收能力
Phe< Tyr< Trp
可用于对蛋白质定性定量分析
两性解离
pI只能实验测定
等电点沉淀
pH=pI时溶解度最低
蛋白质分子净电荷为0，不存在静电斥力，易聚集沉淀
较粗糙，估算
等电聚焦
精确
原理见“蛋白质的分离和纯化”
胶体性质
因两性解离而带有一定的电荷
性质
电泳
布朗运动
丁达尔现象
不能通过半透膜
能以胶体形式存在的原因
蛋白质分子大小已达到胶体质点的范围，具有较大的表面积
蛋白质分子表面有许多亲水基团，能与水形成氢键，形成水化膜，使蛋白质颗粒难以彼此靠近，增加其稳定性，难以聚集或沉淀
非等电状态时，蛋白质分子带有同性电荷而相互排斥
如果这些因素被破坏，蛋白质的胶体性质会被破坏，从而沉淀
生理意义
蛋白质与大量水结合构成各种流动性不同的胶体系统
沉淀反应
原理
破坏水化膜
中和表面电荷
沉淀形式
盐析
在蛋白质溶液中加入一定的中性盐，使其溶解度降低并沉淀析出
最常见的中性盐
硫酸铵
* 溶解度较大 * 硫酸根离子代负电荷较多
原理
与蛋白质争夺水分子，破坏水化膜
中和蛋白质表面电荷
盐析浓度
盐析时所需的盐浓度
一般用饱和百分比表示
不同蛋白质沉淀所需盐浓度不同
可通过调节盐浓度，使蛋白质混合溶液分级沉淀
* 分段盐析
盐溶
溶液中加入的中性盐浓度较低时，蛋白质溶解度增加
原因
* 蛋白质颗粒表面吸附某种无机盐离子后 * 蛋白质颗粒带同种电荷而相互排斥 * 与水分子的作用得到加强
pI沉淀
pH=pI时，蛋白质溶液净电荷为0，失去同种电荷的排斥作用
有机溶剂引起的沉淀
有机溶剂
某些与水互溶的有机溶剂
* 甲醇、乙醇、丙酮等
原理
有机溶剂与水的亲和力大，能破坏蛋白质表面的水化膜
可用于蛋白质分离纯化
某些有机溶剂可引起蛋白质变性
* 最好在低温下进行，降低变性程度
重金属盐作用造成的沉淀
pH>pI时，蛋白质带负电荷
遇到重金属离子，会与其结合形成不溶性的蛋白质盐
重金属离子的作用通常会使蛋白质失活
蛋白质变性
定义
蛋白质受到某些理化因素的作用，其特有的三维结构收到破坏、生物活性随之丧失的现象
不允许有共价键的断裂
导致变性的因素
物理因素
加热
化学因素
强酸强碱
破坏盐键
特殊的化学试剂
尿素
* 破坏氢键
乙醇、丙酮
* 破坏氢键
SDS（阴离子去垢剂）
* 破坏疏水键
氯仿、苯
* 破坏疏水键
重金属盐
* 破坏盐键
变性的特点
通常不可逆
少数可逆
蛋白质的复性
变性的检测标准
生物活性丧失
水溶性下降
内部的疏水基团暴露
更容易被水解
多肽链构象变得更松散、伸展
溶液黏度增加
肽链变得更伸张
又长又细又有刚性的黏度较高（eg. DNA）
结晶行为发生变化
通常丧失结晶能力
三维结构已高度无序
应用
蛋白质折叠与去折叠状态能量差异较小，有时一个点突变就能显著改变蛋白质的热稳定性
制造蛋白质的温度敏感型突变体
更容易发生热变性
可以帮助鉴定一种蛋白质在细胞内的功能
杀菌消毒
急救重金属盐中毒
蛋白质的水解
酸水解
副作用
破坏Trp
三种羟基氨基酸也易被破坏
Gln→Glu
Asn→Asp
试剂
盐酸或硫酸（盐酸更多）
碱水解
副作用
消旋反应
产生D-AA
酶水解
酶的分类
外切蛋白酶
氨肽酶
* 从N端水解
羧肽酶
* 从C端水解 * 分类 * 羧肽酶A * 不能水解P,R,K * 羧肽酶B * 只能水解R,K * 羧肽酶C/Y * 均能水解
内切蛋白酶
胰蛋白酶
* 从R, K的C端切割 * 两种碱性氨基酸 * R-X, K-X * X不能是Pro
胰凝乳蛋白酶
* 从F, Y, W的C端切割 * 三种苯环氨基酸 * F-X, Y-X, W-X * X不能是Pro
胃蛋白酶
* 从L, F, Y, W的N端切割 * 三种苯环氨基酸 * X-L, X-F, X-Y, X-W * X不能是Pro
生物体内的蛋白质水解
只能是酶水解
生物体内蛋白质水解的生理过程
消化道内各种蛋白酶对食物中蛋白质的水解作用
真核细胞内，不需要的或结构异常的蛋白质
共价连接，打上多聚泛酰化标签
* 送入蛋白酶体水解
胱天蛋白酶执行细胞凋亡
水解维持核膜完整的核纤层蛋白
真核细胞自噬
被自噬的蛋白质送往溶酶体或液泡进行水解
化学试剂
CNBr
Met-X
蛋白质的颜色反应
常用的蛋白质定量法
双缩脲法
两个以上的肽键均能反应
受蛋白质特异性氨基酸组成影响较小
适用于毫克级蛋白质的测定
福林-酚试剂法（Lowry法）
灵敏度高
较双缩脲法灵敏
如果样品和标准蛋白质的芳香族氨基酸差异较大时，会有较大的系统误差
考马斯亮蓝法
操作简单，灵敏度高
补充：测定蛋白质浓度的方法
双缩脲法
Folin-酚试剂法
考马斯亮蓝结合法
紫外吸收法
凯氏定氮法
操作
* 蛋白质与浓硫酸和催化剂一同加热硝化 * 蛋白质分解产生氨，与硫酸结成生成硫酸铵 * 碱化蒸馏 * 使氨游离 * 用硼酸吸收游离的氨 * 用硫酸或盐酸的标准溶液滴定吸收的氨 * 根据酸的消耗量换算氮含量，即蛋白质含量
蛋白质的分类
按溶解性
白蛋白（清蛋白）
较小
能溶于水和盐溶液
可被饱和硫酸铵沉淀
球蛋白
通常不溶于水
溶于稀盐、稀酸、稀碱溶液
可被半饱和的硫酸铵沉淀
组蛋白
可溶于水或稀酸
古菌和真核生物染色体的结构蛋白
含丰富的Arg和Lys残基
是一类碱性蛋白质
精蛋白
易溶于水和稀酸
一类碱性蛋白质
含较多碱性蛋白质
缺少Trp, Tyr
存在于成熟的精细胞中，与细胞核DNA结合在一起
醇溶蛋白
溶于70%-80%的乙醇
不溶于水、无水乙醇、盐溶液
多存在于禾本科的种子中
谷蛋白类
不溶于水或稀盐
溶于稀酸、稀碱
存在于植物种子中
硬蛋白类
不溶于水、盐溶液、稀酸、稀碱
主要存在于皮肤、指甲、毛发、蹄、蛛丝中，起支持和保护作用
按化学组成
简单蛋白质（单纯蛋白质）
仅由氨基酸组成，不含其他化学成分
结合蛋白质（缀合蛋白质）
含有非氨基酸成分作为结构的一部分
非氨基酸成分
氨基酸残基侧链上被修饰的各种基团
糖基、脂酰基、甲基、磷酸基团
与蛋白质结合的无机成分
通常是金属离子
辅酶
与蛋白质结合并不紧密的有机分子
* 辅酶I、辅酶II
辅基
与蛋白质紧密结合的有机分子
* FAD、FMN
根据非蛋白成分的性质
糖蛋白
共价结合的糖基
糖基的连接方式
O-糖苷键
* 丝氨酸 * 苏氨酸 * 羟脯氨酸 * 羟赖氨酸
N-糖苷键
* 天冬酰胺
脂蛋白
非共价结合的脂
核蛋白
非共价结合的核酸
色蛋白
共价或非共价结合的生色基团
金属蛋白
配位结合的金属离子
磷蛋白
共价结合的磷酸基团
血红素蛋白
共价或非共价结合的血红素辅基
黄素蛋白
共价或非共价结合的黄素的衍生物
按照分子形状、溶解性质、是否与膜结合
球状蛋白质
纤维状蛋白质
膜蛋白
根据结构和进化上的亲缘关系
家族
在进化上有明确的亲缘关系
至少30%氨基酸序列相同
超家族
在进化上可能有相同的起源
氨基酸序列可能差别较大
栏
具有相同的二级结构，相同的排列和相同的拓扑学连接
不需要具有相同的一级结构，但通常具有相同的生物学功能
根据功能
酶
调节蛋白
运输蛋白
贮存蛋白
运动蛋白
结构蛋白
接头蛋白
保护和防御蛋白
毒蛋白
奇异蛋白
蛋白质的研究方法
蛋白质的分离和纯化
意义
有助于研究蛋白质本身的结构和功能
有助于研究其基因的结构与功能
蛋白质纯化的准备工作
明确纯化蛋白质的目的
测序或质谱分析
约需要1pmol
纯度>97%
制备抗体
需要200-500ug
荧光分析、圆二色性、测热法等结构分析
1-10mg
X射线衍射
10mg或更多
药用和工业用
多多益善
建立蛋白质活性测定的方法
常根据其生物功能进行设计
两个标准
测定是不是灵敏、方便
测定方法是不是高度专一
选择含有目标蛋白的原材料
选择目标蛋白含量高的原材料
某些蛋白质含量本来就很低
可先得到其基因，在利用基因工程进行高表达后分离、纯化
蛋白质纯化的一般注意事项
基本原则
时刻注意维护其稳定性，保护其活性
具体要求
操作尽可能置于冰上或冷库内进行
不要太稀，浓度维持在ug/mL~mg/mL
合适的pH
除非进行等电聚焦或等电点沉淀，缓冲液pH应避免与pI相同
使用蛋白酶抑制剂
避免样品反复冻融和剧烈搅动
防止变性
缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境
在缓冲液中加入0.1-1mmol/L DTT或β-巯基乙醇
防止蛋白质的氧化
加入1-10mmol/L EDTA
防止重金属对蛋白质的破坏
使用灭菌溶液
蛋白质纯化的常见方法
常见方法
分离方法
沉淀
* 溶解性
离子交换
* 电荷
聚焦层析
* 电荷
凝胶过滤
* 大小和形状
疏水作用层析
* 疏水性
亲和层析
* 与特定配体的特异性结合
浓缩方法
沉淀
冻干
反透析
超滤
沉淀与离心
沉淀
原理
* 不同蛋白质在特定条件下溶解性不同
效果
* 一种粗纯化方法 * 常用于将目的蛋白从大体积的粗抽取物中游离出来 * 既能除去许多杂志，又有浓缩之效
实现方法
* 改变pH * 改变离子强度
离心
原理
* 根据分子的特征密度来分离大分子 * 颗粒沉降的速率与颗粒和介质溶液之间的密度之差成正比
沉降系数S=(p-m)V/f
* p：颗粒或大分子的密度 * m：介质或溶液的密度 * V：颗粒体积 * f：摩擦系数
生物大分子沉降系数多数为（1~500）x10^-13s
* 规定1x10^-13s为1S * 一般单纯的蛋白质在1-20S * 较大核酸分子在4-100S * 更大的亚细胞结构在30-500S
应用
* 分离和纯化大分子或亚细胞组分的制备技术 * 分析大分子的流体动力学性质
离心机分类
* 分析用超速离心机 * <1mL * 制备用离心机 * 10-2000mL * 低速离心机 * <10000rpm * 高速离心机 * 20000-25000rpm * 超速离心机 * 可>75000rpm
制备用离心机的应用方法
* 沉降离心 * 离心管内溶液密度均一 * eg. 差速离心 * 梯度离心 * 将待分离的物质在具有密度梯度的介质中进行离心 * 分类 * 密度梯度离心 * 在密度梯度介质中进行的一种沉降离心 * 常用试剂 * 蔗糖、甘油 * 离心时间不能过长 * 样品都会沉降到离心管的底部或某一密度区域 * 平衡密度梯度离心 * 依靠物质的密度不同进行分离 * 常用试剂 * CsCl * 不依赖于时间
透析和超滤
透析
原理
* 生物大分子不能透过半透膜，小分子物质和离子能够通过
应用
* 去除大分子溶液中的小分子物质 * 改变蛋白质溶液的组成
反透析
* 在装有蛋白质或其他大分子溶液的透析袋外，放入高浓度吸水性强的多聚物，透析袋内的水便迅速被袋外多聚物所吸收 * 浓缩袋内液体
超滤
原理
* 利用具有一定大小孔径的微孔滤膜，在常压、加压、减压条件下对生物大分子溶液进行过滤，使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去
应用
* 达到脱盐、浓缩、更换缓冲液的目的，有时可以用来进行滤过灭菌
电泳
等电聚焦电泳（IFE）
操作
* 在凝胶中加入两性电解质 * 在两级间建立pH梯度 * 阴极处高pH，阳极处低pH
应用
* 可实现pI不同的蛋白质之间的分离 * 还可直接测定出各种蛋白质的pI
SDS-PAGE
SDS
* 阴离子去污剂 * 十二烷基硫酸钠 * 能够破坏蛋白质的三维结构，使蛋白质变性而呈线状展开 * 消除蛋白质形状对电泳的影响 * SDS带负电，与蛋白质结合后掩盖了蛋白质间原有的电荷差别 * 消除蛋白质电荷对电泳的影响
PAGE
* 聚丙烯酰胺凝胶电泳 * SDS处理后，影响电泳速度的因素仅有蛋白质的大小
应用
* 根据大小分离不同的蛋白质 * 测定蛋白质的相对分子质量 * SDS会导致寡聚体解聚，破坏蛋白质的四级结构 * 鉴定蛋白质的纯度 * 定量蛋白质 * 二硫键的确定
双向电泳
IFE+SDS-PAGE
顺序不能颠倒
层析
疏水作用层析（HIC）
原理
* 利用不同蛋白质在疏水性质上的差别，对特定蛋白质进行纯化 * 表面亲水基团最少的蛋白质最容易失去水，暴露其疏水基团 * 表面亲水基团最多的蛋白质最难失去水化层，最难与固定相结合
固定相
* 连接到惰性基质上的疏水基团
操作
* 上柱 * 高离子强度 * 高离子强度以除去蛋白质的水化层 * 洗脱 * 降低洗脱液的盐浓度 * 增加洗脱液的去污剂浓度 * 改变pH
亲和层析
原理
* 利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异性的亲和力
固定相
* 带有共价偶联配体的惰性树脂 * 只有和固定相上的配体有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合
洗脱
* 增加游离配体的浓度 * 改变pH
常见生物分子对
* 酶与底物/抑制剂 * 受体与激素 * 抗体与抗原 * 抗体与蛋白质A * 带有组氨酸纯化标签的融合蛋白与金属镍 * 带有单链DNA结合蛋白纯化标签的融合蛋白与单链DNA * 带有谷胱甘肽S-转移酶纯化标签的融合蛋白与谷胱甘肽 * 蛋白质与染料 * 糖蛋白与植物凝集素 * 特异性结合蛋白与被结合的物质
优点
* 过程简单、迅速、高效 * 有时能够“一柱到位” * 对分离含量极少又不稳定的活性物质特别有效
聚焦层析（CF）
原理
* 根据各种蛋白质pI的不同进行分离 * 与等电聚焦和离子交换层析类似 * 在含有pH梯度的离子柱内进行 * 多元缓冲液流过层析柱内的多元缓冲交换剂时，由于交换剂带有具有缓冲能力的电荷基团，会在多元缓冲交换剂的表面从上到下自动形成连续的pH梯度 * 若使用阴离子交换剂 * 当pH低于pI时，蛋白质带正电，不与阴离子交换剂结合 * 随着洗脱液向前移动，固定相中的pH随洗脱时间延长而变化 * 蛋白质移动到高于pI的pH环境时，带负电荷，与阴离子交换剂结合 * 洗脱液流过时 * 环境pH再次低于pI * 蛋白质带正电，从交换剂解离下来
固定相
* 多缓冲交换剂
流动相
* 多元缓冲剂
凝胶过滤层析（分子筛层析、大小排阻层析）
原理
* 按大小分离物质的层析方法（分子形状也起一定作用） * 可用来测定蛋白质的相对分子质量 * 上柱后使用缓冲溶液洗脱 * 大分子无法进入凝胶颗粒的内部，首先流出 * 小分子能自由出入凝胶颗粒内部，流出时间更长
固定相
* 装在层析柱内细而多孔的凝胶颗粒 * 葡聚糖 * 琼脂糖 * 聚丙烯酰胺
高效液相层析（HPLC）
原理
* 与经典的液相层析和气相层析一致 * 颗粒更细，流速更快，实现了自动化
反向HPLC
* 固定相 * 共价结合到硅上的碳氢链 * 原理 * 与疏水层析一样 * 洗脱 * 降低离子强度 * 增加洗脱液的疏水性
几种层析分离方法的比较
方法
* 容量 * 纯化位置 * 成本
离子交换层析
* 高 * 早期 * 低
疏水层析
* 高 * 早期 * 中
聚焦层析
* 中等 * 后期 * 高
凝胶过滤层析
* 低 * 后期 * 低
亲和层析
* 高 * 任何时段 * 中
补充：分配层析
定义
* 根据一种或多种化合物，在两种不相混合的溶剂间的分配来分离物质的方法 * 相当于一种连续液-液萃取法
常见方法
* 逆流分溶 * 纸层析 * 聚酰胺薄膜层析 * 薄层层析
蛋白质纯化方案的设计
选择一种物理或化学的途径进行分级分离
目的
除去污染物
合并有活性的部分
经历多轮分级处理
可测定分离样品的活性，计算每次分离的比活性
比活性：每毫克蛋白内的蛋白活性
每一级都应有杂质的去除和比活性的提高
但几乎总会有总活性的损失
常见的阶段
破碎细胞或组织（混合和匀浆）
去除残渣（离心）
沉淀/浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）
纯化（层析）
鉴定
纯度、大小、pI的测定
蛋白质纯度的测定
一般认为，当一种蛋白质被纯化到恒定的比活性或达到均一性后，就可认为是纯品
其他补充验证方法
电泳法
纯净的蛋白质电泳的结果应该是一条带
SDS-PAGE会破坏蛋白质的四级结构，可能出现几条带
化学法
进行N端或C端测定
* 纯品蛋白质应该具有恒定的N端或C端组成
仪器法
使用HPLC或质谱分析
* 纯品蛋白质在HPLC只表现单一的峰，质谱分析测定的相对分子质量与实际的值一致
检测纯度必须综合两种原理不同的分析方法
eg. 不能仅用凝胶过滤和SDS-PAGE
蛋白质大小（质量）的确定
SDS-PAGE
原理
lgMr=k-bm
Mr：相对分子质量
k：常数
b：斜率
m：迁移率
需要几种已知大小的蛋白质为标准，根据其相对分子质量的对数对电泳迁移率作图，绘制出标准曲线
凝胶过滤法
原理
不同排阻范围的凝胶有一特定的蛋白质相对分子质量的范围
在此范围内，相对分子质量的对数和洗脱体积之间呈线性关系
用几种已知大小的蛋白质为标准，以每种蛋白质的洗脱体积对其相对分子质量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线
超速离心法
原理
蛋白质溶液经高速离心分离时，沉降速率与蛋白质颗粒大小成正比
应用光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降行为，判断出其沉降速率，求出沉降系数S
将S代入公式，计算出相对分子质量
质谱法
优点
较好的灵敏度（亚微克级）、准确度
能精确测定
蛋白质相对分子质量
肽链氨基酸排列顺序
含有二硫键的蛋白质的二硫键的数目和位置
原理
通过电离源将蛋白质分子转化为离子
利用质谱分析仪的电场、磁场，将具有特定质量与电荷比值（M/Z）的蛋白质离子分离开来，收集分离的离子，确定M/Z值，分析鉴定未知蛋白
蛋白质等电点的测定
等电点沉淀
等电聚焦
蛋白质在机体内表达的分析
Western Blotting
原理
一种蛋白质与其抗体之间的结合是高度特异性的
可用其抗体对其进行定性和定量分析
抗体需与酶偶联
酶能在原位将无色底物催化为有色产物
实际操作可制备偶联酶的二级抗体
* 二级抗体可以通用
不同蛋白质在经凝胶电泳分离后，需将其从凝胶上通过吸印的方法转移到机械性能更好的滤膜等材料上
蛋白质一级结构的测定
间接测定
原理
先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通用的遗传密码表，间接推导出由其决定的氨基酸序列
原核生物
直接从其基因组中得到目标蛋白的基因，测定其碱基序列
找出可读框，根据遗传密码反推氨基酸序列
真核生物
先得到目标蛋白的cDNA，测定其序列
真核生物基因一般含有内含子，不能直接从基因组DNA推断
找出可读框，反推氨基酸序列
优点
快速，无需纯化蛋白质
缺点
无法确定加工后的蛋白质的最终序列
无法确定修饰的氨基酸，得不到任何二硫键的信息
直接测定
步骤
纯化目标蛋白
纯度>97%
拆分肽链
拆分次级键以拆分亚基
* 极端pH * 8mol/L尿素 * 8mol/L盐酸胍
打破二硫键
还原方法
* 巯基乙醇 * 还原型二硫苏糖醇 * 使用过甲酸直接氧化 * 用碘代乙酸或γ溴代丙胺将还原出的巯基氧化 * 防止其重新形成二硫键
分析各单链的氨基酸组成
不能直接给出一根多肽的每一种氨基酸残基的数目
但能给出各种氨基酸残基间的相对比例
末端氨基酸残基的鉴定
若常规方法无法测出
* N端或C端被一些特殊的基团封闭 * 需特殊的试剂解除封闭
N端
* Sanger试剂 * DNFB * Edman试剂 * PITC * 丹磺酰氯（DNS-Cl）
C端
* 酶法 * 羧肽酶 * 越靠近C端的氨基酸残基释放速率越快 * 化学法 * 还原法 * 使用硼氢化钠将C端氨基酸残基还原成氨基醇 * 肼解法 * 使用无水肼在90℃下处理蛋白质20-100h，切开蛋白质分子上的所有肽键，产生氨脂酰肼，唯独C端氨基酸以游离形式出现 * 高比例的肼能诱导副反应，一般只用于末端能抵抗羧肽酶水解的肽
将肽链切成小的片段，再测定各小片段的氨基酸序列
Edman降解不适合>50aa
切割方法
* 酶法 * 化学法 * 溴化氰CNBr * 专门切割Met的C端 * Met-X * 羟胺 * pH=9时 * 切割Asn-Gly * 温和的酸性 * 切割Asp-Pro
切割后需分离纯化
* 每一个肽段需单独进行氨基酸组成分析、末端氨基酸测定、全序列测定
测定方法
* Edman降解 * 从C端进行降解获得序列的方法 * 优点 * Edman降解的有效补充 * 如果N端被封闭，无法进行Edman降解 * 有助于对蛋白质翻译后C端剪切位点的鉴定 * 基因序列的验证 * 重组DNA技术中寡聚核苷酸探针的设计 * 质谱 * 方法 * 串联质谱法 * 原理 * 利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳定离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基 * 基本过程 * 从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱 * 经惰性气体碰撞后，肽段沿肽链在肽键断裂，形成更小的肽链 * 形成的产物离子碎片在化学上是可预测的 * 由所得到的各肽段峰之间的质量差异，可推出前体的氨基酸序列 * 梯形肽片段测序法 * 原理 * 用化学探针或酶解使蛋白质或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基 * 产生包含仅差于1个氨基酸残基质量的系列肽 * 梯状肽 * 质谱检测 * 优点 * 能测定翻译后修饰
选择不同的切点，重复上一步
根据片段重叠法，推断出肽链的全序列
二硫键的定位
基本步骤
* 保留目标蛋白上的二硫键，直接用一种蛋白酶水解 * 找出含有二硫键的肽段 * 寻找方法 * 对角线电泳 * 基本步骤 * 将蛋白质部分水解物样品弥散地点在滤纸的一端，进行第一向电泳 * 结束后，将样品条剪下 * 用过甲酸蒸汽处理2h * 断裂二硫键 * 含有二硫键肽段的净电荷发生了改变（负电荷增加） * 将滤纸条附着于另一张新的滤纸上，进行第二向电泳 * 电泳条件与第一向完全相同，与第一次的方向呈直角 * 电泳结果 * 不含二硫键的肽段两次电泳情况相同，位于滤纸的对角线上 * 含二硫键的肽段由于电荷发生变化，偏离了对角线 * 用“打破二硫键的方法”将二硫键拆开 * 分别测定两个肽段的顺序 * 在将其顺序与已测出的蛋白质一级结构进行比较后，定位二硫键的位置
蛋白质三维结构的测定
X射线晶体衍射
核磁共振波谱法
冷冻电镜
同源建模
蛋白质功能的研究
结合三维结构对其直接进行研究
通过观察和分析破坏目标蛋白质基因或抑制目标蛋白质基因的表达而造成的表型变化
基因敲除
基因敲减
显性负性突变
利用生物信息学的方法对其功能进行预测
多肽的固相合成
原理
根据事先设计好的多肽序列
先将要合成肽链的C端氨基酸的羧基以共价键固定到一个不溶性的高分子树脂上
从C端向N端，重复“去保护”
除去前一个已与固相树脂相连的氨基酸α-氨基上的保护基团
常用的氨基保护基
* 苄氧羰基（Cbz基） * 叔丁氧羰基（Boc基） * 联苯异丙氧羰基（Bpoc） * 芴甲氧羰基（Fmoc）
活化
激活下一个待连的氨基酸的羧基
偶联
让去保护的氨基和活化的羧基之间缩合，形成肽键
常用的缩合剂
* N,N'-二环己基碳二亚胺（DCCI）
洗脱和过滤
去除没有反应完的各种试剂
重复上述过程，直到达到所要合成的肽链长度
去除侧链上的保护基团
将肽链从树脂上裂解下来
纯化
优点
解决了分离、纯化方面的难题
每步反应后只需简单地洗脱树脂，便可达到纯化目的