基因工程的基本操作程序知识点总结

基因工程的基本操作程序知识点总结：反转录法：以目的基因的mRNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补配对的单链DNA，在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。

1.2基因工程的基本操作程序知识点总结

• 目的基因的获取
  • 来源：自然界已有的物种中分离出来，也可用人工的方法合成
  • 定义：主要是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
  • 获取方法：基因文库
    • 定义：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌群中储存，各个受体菌分别有这种生物的不同的基因。
    • 分类
      • 基因组文库：包含了一种生物的所有基因（有启动子、终止子）
      • 部分基因文库（cDNA文库）：只包含一种生物的部分基因（无启动子、终止子）
    • 构建
      • 基因组文库：提取DNA，选用限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，用DNA连接酶，将DNA片段与载体连接起来，导入受体菌群中储存。
      • 部分基因文库：用逆转录酶将某种生物的mRNA反转录形成的多种互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中。
  • PCR技术
    • 全称：多聚酶链式反应
    • 实质：在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
    • 原理：DNA双链复制
    • 数量：指数型增加
    • 前提：一对引物、一段已知目的基因的核苷酸序列、DNA聚合酶、Taq酶（热稳定DNA聚合酶）、四种游离的脱氧核苷酸
    • 扩增过程
      • 解旋：DNA受热变性后解旋为单链
      • 复性：引物与单链相应互补序列结合
      • 延伸：在DNA聚合酶作用下延伸
  • 人工合成
    • 反转录法：以目的基因的mRNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补配对的单链DNA，在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA
    • 化学合成法：如果基因较小，核苷酸序列已知，也可通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成，不需要模板。
• 基因表达载体的构建✡
  • 目的：目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，使目的基因可以表达或发挥作用。
  • 结构
    • 启动子：位于基因首段，是RNA聚合酶识别并结合位点，启动转录
    • 终止子：基因末端，终止短路
    • 标记基因：为了鉴别受体细胞是否含有目的基因，将含有目的基因的细胞筛选出来。
    • 标记原点
• 将目的基因导入受体细胞
  • 唯一不涉及碱基互补配对原则的步骤
  • 导入植物细胞
    • 农杆菌转换法
      • 对象：双子叶或裸子植物
      • 植物受损伤时，伤口处分泌大量酚类化合物吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌上的Ti质粒上的DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
      • 植物组织培养技术，原理：植物细胞具有全能性
      • 受体细胞：体细胞（常用）和受精卵
      • 优点：经济和有效
      • 转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞中维持稳定和表达的过程
    • 基因枪法
      • 常适用于单子叶植物
      • 成本较高
    • 花粉管通道法
      • 获取了转基因抗虫棉
  • 导入动物细胞
    • 方法：显微注射技术
    • 受体细胞：受精卵
    • 转基因动物：基因组细胞中含有外源基因的动物
  • 导入微生物细胞
    • 原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质较少
      • 基因工程中常用细菌、酵母菌做受体细胞
    • 多用大肠杆菌
    • 方法：⑴用钙离子处理，使之成为能吸收周围环境中DNA分子的生理状态， 成为感受态细胞
      • ⑵ 将重组表达载体DNA分别荣誉缓冲液与感受态细胞混合， 在一定温度下促进其吸收DNA分子，完成转化
• 目的基因的检测与鉴定
  • 检测DNA上是否插入了目的基因
    • 目的基因是否在受体细胞中稳定遗传的关键
    • 方法：DNA杂交技术
    • DNA分子水平的检测
    • 原理：碱基互补配对原则
    • 步骤：⑴在目的基因的片段上用放射性同位素等作标记，作为探针
      • ⑵使探针与基因组DNA杂交
    • 现象：显示出杂交带，目的基因已插入染色体DNA中
  • 检测目的基因是否转录mRNA
    • 方法：分子杂交技术
    • 现象：显示出杂交带
    • RNA分子水平的检测
  • 检测目的基因是否翻译成蛋白质
    • 方法：抗原—抗体杂交
    • 现象：若有杂交带出现，目的基因已表达
    • 蛋白质水平检测
  • 个体生物水平鉴定
    • 方法：抗虫或抗病的接种实验
    • 现象：是否抗虫或抗病
  • 场所：体外