聚合酶链（PCR）反应体系和条件

这是一个关于聚合酶链（PCR）反应体系和条件的思维导图，包括：反应体系和反应条件（温度与时间的设置、循环次数）。

聚合酶链（PCR）反应体系和条件

• 反应体系
  • 模板
    • RNA
      • 当用 RNA 做模板时，先经过反转录产生 cDNA ，然后再进行 PCR 反应。
    • DNA
      • DNA 模板的来源广泛，可从微 生物中或血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞等细胞中提取 DNA ，也可将固定和包埋的组织标本脱蜡、蛋白酶 K 消化后提取 DNA 。
      • DNA 作模板时 浓度一般为500~1000ng。
      • 质粒 DNA 作模板时 浓度为10ng左右。
  • 引物
    • 引物是一段与模板 DNA 链特异结合的寡核苷酸片段，对于 DNA 的扩增起到引发的作用。扩增是从引物的3﹣端延伸的，引物决定了 PCR 扩增片段的长度、位置和结果。
    • 引物的长度大多为20~30个碱基。
    • 引物遵循的原则
      • ①引物长度，15~30bp，常用为20bp左右。
      • ②引物扩增跨度，以200~500bp为宜，特定条件下可扩增至10kb的片段。
      • ③引物碱基， G + C 含量以40%~60％为宜。
      • ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3﹣端的互补，否则会形成引物二聚体产生非特异的扩增条带。
      • ⑤引物3﹣端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。
      • ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
      • ⑦引物的特异性，引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。
  • 酶及其浓度
    • Taq DNA聚合酶
      • ①耐高热
      • ②在热性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。
      • ③高催化性
    • Taq DNA 聚合酶在一个典型的 PCR 反应中常用浓度为1-2.5IU/100u体系，浓度过高可引起非特异性扩増，浓度过低则合成产物量减少。 Taq DNA 具有5ー3聚合酶活性和5一3‘外切酶活性没根一外切酶洁性，在 PCR 反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有反正功能。
  • dNTP的质量与浓度
    • 标准 PCR 反应体系中包含4种等物质的量的三磷酸脱氧核苷酸( dNTP )．即 dATP、dGTP、dTTP、dCTP ，为 PCR 反的合成原料。
    • 每种 dNTP 的浓度一般应为 200~250pmol/ L。
  • 反应缓冲液
    • 最常用的缓冲液是10~50mmol/ L 的 Tris - HCI 缓冲液（20℃时 pH 8.3~8.8)。 反应缓冲液中还包含有二价阳离 子，因为热稳定 DNA 聚合酶要求有游离的二价阳离子，常用的是 Mg 2+。
• 反应条件
  • 温度与时间的设置
    • 变性温度与时间
      • 93~94℃ 使模板 DNA 变性 ，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对爵的洁性有影响。
    • 退火温度与时间
      • 变性后温度快速冷却全40-60℃，可使引物和模板发生结合。 通常 退火温度应低于引物 Tm（解链温度）值的25℃左右，在 Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大地减少物和模板间的非特异性结合，提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为30~60秒。
    • 延伸温度与时间
      • Taq DNA 聚合酶的 最适温度为70~75℃ ，通常选择温度为72℃ ，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 PCR 延伸反应的时间 一般1kb以内的 DNA 片段，延伸时间为1分钟，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。
  • 循环次数
    • PCR 循环次数决定扩增的程度。 一般的循环次数为25~40次。