导图社区 十四、基因重组
①化学合成法:已知某基因的核苷酸序列,直接合成目的DNA;②基因组DNA文库:以mRNA为模板合成互补的DNA。
编辑于2022-06-29 16:27:07这是一个关于核酸的结构与功能的思维导图,包括:summary、structure and function of RNA、physicochemical property of nucleic acids、nuclease等内容。
这是一个关于十六 细胞信号传导的分子机制的思维导图,包括:信息分子(配体)、受体、效应酶、激活的相关酶、传导通路、细胞信号转导、异常与疾病。
氨的主要代谢去路--在肝中合成尿素:概念:在肝脏中合成尿素的过程,通过此循环最终2分子的NH3与1分子的CO2 缩合生成了尿素,由于在此过程中鸟氨酸能再次生成,并被循环利用, 故称为鸟氨酸循环。
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这是一个关于核酸的结构与功能的思维导图,包括:summary、structure and function of RNA、physicochemical property of nucleic acids、nuclease等内容。
这是一个关于十六 细胞信号传导的分子机制的思维导图,包括:信息分子(配体)、受体、效应酶、激活的相关酶、传导通路、细胞信号转导、异常与疾病。
氨的主要代谢去路--在肝中合成尿素:概念:在肝脏中合成尿素的过程,通过此循环最终2分子的NH3与1分子的CO2 缩合生成了尿素,由于在此过程中鸟氨酸能再次生成,并被循环利用, 故称为鸟氨酸循环。
基因重组
概念
DNA重组:: DNA 分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程,包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型
重组DNA技术:又称分子克隆、DNA克隆或基因工程,是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增值形成新DNA分子的过程
工具酶
构建重组DNA
①限制性核酸内切酶(RE)
切的是DNA(核酸)在DNA内部(内切)位点具有特异性(限制性) !RE对甲基化的自身DNA是不起作用的
识别DNA特异序列,裂解磷酸二酯键,切断DNA
分型
Ⅰ型、Ⅲ型:特异性不强,在重组DNA技术中应用价值不大
Ⅱ型:对DNA进行精确切割,识别回文序列
粘性末端(黏端):Ⅱ型RE错位切割双链DNA,产生的5‘或3’突出末端
回文结构:又称反向重复序列,是指在两条核苷酸链中,从5‘→3’方向的核苷酸序列是完全一致的,大多数RE的识别序列为回文结构
方法:折起来看看能不能连接
同尾酶:RE识别的序列不同但是切割后产生的黏端却相同
GATC为其5‘黏端也叫配伍末端
②DNA连接酶:催化DNA中相邻的5‘-磷酸基和3’-羟基末端之间形成磷酸二酯键,使DNA切口封口或使两个DNA分子或片段连接
③碱性磷酸酶:切除末端磷酸基
在基因末端有磷酸基团和羟基,防止切断基因后的断端重新连接上去而切除末端磷酸
④DNA聚合酶Ⅰ:合成双链cDNA分子或片段连接;缺口平移法制作高比活性探针;DNA序列分析;填补3‘-端
⑤klenow片段
具有完整DNA聚合酶Ⅰ的5’→3‘聚合,3’→5‘外切活性,而无5’→3‘外切活性(是DNApol的大片段)
常用于cDNA第二链合成,双链DNA3’-端标记
⑥逆转录酶:合成cDNA(合成cDNA的第一链);替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补,标记或DNA序列分析
⑦多聚核苷酸激酶:催化多聚核苷酸5‘-羟基末端磷酸化,或标记探针
⑧末端转移酶:3’-OH末端进行加尾
基本过程
①目的DNA的分离获取(分)
①化学合成法:已知某基因的核苷酸序列,直接合成目的DNA
②基因组DNA文库:以mRNA为模板合成互补的DNA
③cDNA文库/逆转录文库:以mRNA为模板合成互补的DNA
④PCR法(最常用):已知目的基因或DNA片段两端的序列,合成引物,进行高效体外扩增
⑤酵母杂交系统:单杂交系统克隆DNA结合蛋白的编码基因,或用双杂交系统克隆相互作用的蛋白质的编码基因。
②载体的选择与构建(选)
概念:携带目的外源DNA片段,用于实现目的DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达
分类
克隆载体
要求
①能进行自主复制
至少有一个复制起始点使载体在宿主细胞自主复制以使外源DNA同步扩增(最基本)
②含有选择标志基因
至少有一个选择标志以区分含与不含载体的细胞
③有事宜的RE的单一切点
有适宜的RE单一切点以供外源基因插入载体
常用
质粒
主要存在于细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传DNA分子,为环状双链的超螺旋结构
不同酶的识别序列可以重叠
噬菌体DNA:常被用作克隆载体的噬菌体DNA有λ和M13噬菌体DNA
其他:柯斯(cos)质粒载体(黏粒载体)、细菌人工染色体载体、酵母人工染色体载体
柯斯质粒是人工构建的含入DNA Cos 序列和质粒复制子 的特殊类型质粒载体,自身分子量一般只有 5- 7kb, 但能携带的外源 DNA 片段最大可达 45kb
表达载体
原核表达载体(大肠杆菌)
真核表达载体
有MCS
③目的NA与载体连接(接)
目的基因+载体=重组DNA
分类
黏性连接(最准确)
单一相同黏端连接(同一RE酶切位点的连接)
不同黏端连接(属于定向克隆)
其他:人工接头法,加同聚物尾法
在外源基因和载体DNA末端添加同聚物序列后再进行连接 -----同聚物加尾连接 在外源基因和载体DNA末端添加短核苷酸序列,人为制造粘性末端再进行连接属于-----人工接头
平端连接
①限制性内切酶切割产生的平端;②黏端补齐或切平形成的平端
黏-平端连接属于(属于定向克隆)
指目的DNA和载体之间通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接。
④重组DNA转入受体细胞(转)
转化:外源DNA直接导入细菌或真菌
将重组质粒转化进入大肠杆菌进行扩增是最常用的策略
转染
用于转染哺乳类细胞的常用载体为逆转录病毒RNA
将外源DNA直接导入真核细胞(酵母除外)的过程
将噬菌体DNA直接导入受体细菌的过程称为传染
感染:是指以病毒颗粒作为外源DNA运载体导入宿主细胞的过程
转导:病毒从感染的(供体)细胞释放再次感染另一个(受体)细胞时,发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为传导作用。
接合: 细菌的遗传物质在细菌细胞间通过细胞-细胞直接接触或细胞间桥样连接的转移过程
转位:基因从原来位置转到基因组的另一位置
⑤重组体的筛选与鉴定(筛)
借助载体遗传标记:抗生素抗性标记、基因的插入失活/插入表达特性、标志互补筛选(α互补)、噬菌体的包装特性
①基因插入后就失活,或者插入某个基因就能表达对应相应的产物 (例如 pBR322 质粒含有氨节 青霉素抗性基因 (ampR) 和四环 抗性基因 (tel) , 如将目的 DNA 插入 tel 中, tel 失活,含 重组 DNA 的细胞只能在含氨节青霉素的培养 基中生长, 不能在含四环素的培养基中生长) ②标记互补就是细胞的某个基因缺少当插入那个基因后马上就可以获得其表达产物 (例如αω在一起才具有β半乳糖苷酶活性,而突变的大肠杆菌只能合成ω片段,将目的基因导入可以编码α片段的基因中间,然后再转入细菌中可以发现还是不能合成完整的β半乳糖苷酶产物是白色,而没有目的基因导入的却可以正常编码出产物是蓝色 ③噬菌体可以传染也可以感染
借助序列特异性筛选:RE酶切法、PCR法、核酸杂交法、DNA测序法(最准确)
借助亲和筛选法:抗原-抗体、配体-受体
⑥克隆基因的表达
表达人类蛋白质的最理想的表达体系是哺乳类细胞表达的体系
分为原核表达体系和真核表达体系
应用
广泛应用于生物制药:提高抗生素、维生素、氨基酸等药物的产量;生产有药用价值的蛋白质/多肽与疫苗等
转基因和基因打靶→制备人类疾病的生物模型,探讨疾病的发病机制和有效的防治措施
基因诊断和基因治疗
人类基因组计划:主要目标是揭示人类遗传信息的组成和表达