色谱法导论

色谱法（chromatography）又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。

色谱法导论

• 色谱法的特点
  • 分离效率高
  • 灵敏度高
  • 分析速度快
  • 应用范围广
  • 不足之处
    • 被分离组分的定性较为困难
• 色谱法分类
  • 按两相物理状态分类
    • 气固色谱（GSC）
    • 气液色谱（GLC）
    • 液固色谱（LSC）
    • 液液色谱（LLC）
  • 按固定相的固定方式分类
    • 柱色谱
    • 薄层色谱
    • 纸色谱
  • 按分离机理分类
    • 吸附色谱
    • 分配色谱
    • 离子交换色谱
    • 凝胶色谱
    • 离子对色谱
    • 配合色谱
    • 亲和色谱
• 色谱分离条件
  • 两组分峰间距足够远
    • 由各组份在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的热力学性质决定
  • 峰区域宽度宽足够小
    • 由组份在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程动力学性质决定
• 分离度
  • 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响
    • 保留值之差──色谱过程的热力学因素
    • 区域宽度──色谱过程的动力学因素
  • 是柱效能和选择性影响的总和，可作为衡量色谱柱总分离效能的指标
  • 定义
    • 相邻两色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽度平均值之比
  • ★ R 越大，表明两组分分离效果越好， ★ 保留值之差取决于固定相的热力学性质 ★ 色谱峰宽窄反映色谱过程动力学因素，柱效能高低
  • R=1.5:达99.7%(相邻两峰完全分离的标准)
• 色谱分离基本方程
  • 分离度与柱效
    • ☆ 分离度与柱效的平方根成正比， ☆ 对于一定理论板高的柱子，分离度的平方与柱⻓成正比 ☆ r21一定时，增加柱⻓，可提高柱效和分离度，但组分保留 时间增加且峰扩展，分析时间⻓
  • 分离度与r2，1
    • ☆ 增大r21是提高分离度的最有效方法 ☆ 增大r21的最有效方法是选择合适的固定液
  • R受柱效(n)、相对保留值(r2,1)、容量因子 (k)的控制
• 色谱定量分析
  • 定量依据:色谱峰面积与待测物的质量或浓度成正比。
    • mi :待测物质i的质量 f i: 校正因子 Ai :峰面积
  • 峰面积的测量
    • 峰高(h)乘半峰宽(W 1/2)法(对称峰)
      • A = 1.064 h· W 1/2
    • 峰高乘平均峰宽法(不对称峰)
      • A=h·( W0.15+W0.85 )/2
  • 定量校正因子
    • 试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比
    • 绝对校正因子f i ，单位峰面积对应的物质的质量
      • f i =m i / Ai
    • 相对校正因子f ’i :即组分与标准物质的绝对校正因子之比
    • 质量校正因子f ’m : 被测物质用质量单位
    • 摩尔校正因子f ’m :被测物质用摩尔为单位
  • 常用的几种定量方法
    • 归一化法:所有出峰组分含量之和以百分之百计算
      • 特点
        • 归一化法简便、准确
        • 进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大
        • 仅适用于试样中所有组分全出峰的情况
    • 外标法：标准曲线法
      • 外标法不使用校正因子，不加内标物
      • 适用于大批量试样的快速分析
      • 进样量和操作条件变化对结果准确性影响较大
    • 内标法：准确称取一定量的试样m试，加入一定量内标物mS
      • 特点
        • 内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大
        • 每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析
    • 内标标准曲线法―简化的内标法
      • 称取同样量的试样、加入恒定量的内标物
      • 加入恒定量的内标物
• 保留值与分配系数、分配比的关系
  • 分配比等于调整保留时间与死时间的比值
  • 对1、2两组分的相对保留值
    • 1.两组分的K与k相差越大，则分离越好 2. 在柱温、柱压及固定相性质不变的条件下，r2,1 不变
• 分配系数与分配比的关系
  • Vm为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积(V0 ); VS为固定相体积;式中β为相比
• 色谱常用术语
  • 色谱图
    • 流出物通过检测器产生的响应信号 对时间（或流动相体积）的曲线图
      • 色谱峰
        • 单个组分的色谱图峰形
      • 在适当的色谱条件下，每个组分对应的色谱峰一般呈正态分布
  • 基线
    • 色谱柱中只有载气而无试样通过时，检测器响应信号的记录是反映检测系统噪声随时间变化的线
      • 实验条件稳定时，基线是一条直线
  • 峰高（h）
    • 色谱峰最高点与基线之间的距离
  • 区域宽度
    • 色谱流出曲线的重要参数之一，反映出色谱柱的分离效能，通常越窄越好
      • 1⃣️标准偏差σ
        • σ是 0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半
      • 2⃣️半峰宽W1/2
        • 色谱峰高一半处对应的色谱峰宽度
        • 单位
          • 距离 mm或cm
          • 时间min或s
        • 与标准偏差关系
          • W1/2=2.254σ
      • 3⃣️峰底宽Wb
        • 色谱峰两侧拐点作切线与基线交点间的距离
        • 与标准偏差关系
          • Wb=4σ
  • 保留值
    • 试样各组分在色谱柱中保留行为的量度
      • 保留时间t R
        • 组分通过色谱柱所需要的时间，从进样到出现组分色谱峰最大值的时间，单位为min或s
        • 取决于色谱过程的热力学因素
      • 死时间t 0
        • 不被固定相吸附或溶解的组分从进样到出现色谱峰最大值所需的时间，也是组分在流动相消耗的时间
      • 调整保留时间t' R
        • 保留时间-死时间
        • 组分在固定相停留的时间
      • 保留体积 VR
        • 从进样到出现某组分色谱峰最大值通过的载气体积
        • VR=tR•q0
          • q0:色谱柱出口的载气流量
      • 死体积V0
        • 在t0这段时间内通过色谱柱的载气体积，实际上色谱柱内载气所占的体积
        • V0=t0•q0
      • 调整保留体积V’R
        • =保留体积-死体积
      • 相对保留值r2，1
        • 只与柱温和固定相性质有关
        • 相对保留值越大，两峰距离越远，色谱柱分离选择性越强，越容易分离；=1时，两组分色谱峰重叠
      • 保留指数Ix
        • 将被测组分的保留值以两个与它相邻的正构烷烃来标定
  • 分配系数K
    • 组分在固定相和流动相中的质量浓度之比，K=ρs/ρm
    • 试样一定时，K主要取决于固定相性质
    • 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础;某组 分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出;组分的K越大，出峰越慢
    • 组分在各种固定相上的分配系数K不同，选择适宜的固定相可改善分离效果
  • 分配比κ
    • 分配比亦称容量比、容量因子，指在一定温度、压力下，组分在两相中达到分配时，固定相和流动相的质量之比，κ=ms/mm
    • 随着固定液的量而改变，分配比越大，组分分配在固定液中的量越多相当于柱的容量越大
  • 1. K与k都与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随柱温、柱压的变化而变化。 2. K与k都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越⻓。
• 色谱理论基础
  • 塔板理论
    • 理论塔板数n
      • 理论塔板数可根据色谱图上所测得的保留时间 (tR)和峰底宽(wb)或半峰宽( wh/2 )按下式推算
    • 理论塔板高度H
      • H=L/n
    • 当L一定，n越大， H越大，色谱峰越窄，柱效越好
    • 有效塔板数
    • 有效塔板高度
  • 速率理论
    • 板高方程
      • H= A+ （B／u）+ C·u
        • u 为流动相线速度
    • A─涡流扩散项
      • 提高柱效方法
        • 采用颗粒小、粒度均匀的固定相，均匀的填充
    • B—分子扩散项
      • 提高柱效方法
        • M载气↑( Dm ∝ [(M载气) -1/2] )，降低柱温↓ ，提高柱压↑ ，流 速↑( u: 为载气的线速度，流速↑ ，滞留时间↓ ) ，B值↓
    • C —传质阻力项
      • 提高柱效方法
        • 采用小颗粒固定相，液膜厚度小，小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。
    • 载气流速与柱效——最佳流速
      • u高时: 传质阻力项是影响H的主要因素
      • u低时: 分子扩散项是影响H的主要因素