王镜岩 生物化学 上册 2、肽，蛋白质 完整版

王镜岩 生物化学 上册 第二章肽，蛋白质，包括肽的基本概念、蛋白通论、蛋白质的结构层次、蛋白质的一、二、三、四级结构、氨基酸序列与生物进化等知识点。

肽，蛋白质

• 肽
• （一）肽和肽键的结构
  • ★ 肽(peptide)和蛋白质是氨基酸的线型多聚体，因此也称肽链（peptide chain)或多肽链。
  • ● 不多于20个残基的肽叫寡肽(oligoteptide)。● 多于20个残基的肽叫多肽。
  • 肽键
    • ● 蛋白质中氨基酸的基本连接方式是肽键。此外还有二硫键。
    • ★ 肽键(peptide bond)：由一个AA的α - 氨基与另一个AA的α - 羧基除去一分子水缩合而成。由于N、C原子的sp2杂化轨道，使其具有部分双键的性质。
    • 肽基 / 肽单位 ：肽键中的酰胺基（-CO-NH-）。
    • 肽键实际结构是一个共振杂化体（反式构型更稳定）。
  • ● 氨基酸残基 ：肽链中的AA由于肽键的形成已不是原来完整的分子，因此称为AA残基。
  • ● 氨基端（N端）：在一条多肽链的主链中，含有游离α - 氨基的那一末端的AA残基。 ● 羧基端（C端）：另一末端含有游离α - 羧基的AA残基称为羧基端。
    • AA序列从氨基端由左到右阅读。
• （二）肽的物理和化学性质
  • 物理
    • 肽的晶体熔点高，是离子晶格。
  • 化学
    • ①肽在水溶液中也能够带电，也有自己的等电点pI，其计算与测定同于氨基酸。（肽至少有一个游离的氨基和游离的羧基，是两性化合物，至少有2级解离，通常有多级解离。）
    • ② 肽游离的α-氨基、α-羧基、R基团的化学反应与氨基酸类似。
    • ③ 双缩脲反应：与碱性硫酸铜溶液反应，生成紫红色化合物，再借助分光光度计可测定pro的含量。【凡大于三肽的肽都能发生此反应，2肽不行；AA无此反应。】
• （三）活性肽 （具有活性的多肽）
  • 1、形成途径
    • ① 通过核糖体的途径【L型】
    • ② 不通过核糖体的酶促合成途径【D型】
  • 2、谷胱甘肽
    • 由谷氨酸、Cys、甘氨酸形成含有巯基的三肽。具有抗氧化和整合解读作用。
    • 谷胱甘肽有还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种，生理情况下GSH占多数。谷胱甘肽还原酶催化两型间的互变，该酶的辅酶为磷酸糖旁路代谢提供的NADPH。。
    • 还原性谷胱甘肽（GSH）在红细胞中作为巯基缓冲剂，维持血红蛋白或其他Pro的Cys残基处于还原态。【氧化型：GSSG】
  • 3、α-鹅膏蕈碱
    • 对动物具有致死作用：与真核生物的RNA聚合酶II进行特异性结合，抑制磷酸二酯键的形成，进而抑制RNA链合成的起始和延长。但不影响原核生物的RNA合成。
• 一、蛋白通论
• （一）蛋白质的元素组成
  • C（50%）、H（7%）、O（23%）、N（16%）、S及P、Fe等微量元素。并且在糖和脂类中不含N，可用凯氏定氮法根据样品中N的含量测定Pro含量。
  • 蛋白质含量＝蛋白质含N量×6.25
• （二）Pro的形状 / 分类
  • 1、根据组成分类
    • 单纯Pro
      • ：仅由AA组成，不含其他化学成分的Pro。
    • 缀合Pro
      • 定义：含有一定的非肽成分（金属离子、脂质、糖类等 ）的Pro，这种肽成分可松散或紧密地与多肽链结合。
      • 脱辅基蛋白质
      • 辅基（非Pro成分）
  • 2、根据形状和溶解度分类
    • 纤维状蛋白
      • 主要起结构作用，大多不溶于水/稀盐aq。（少数如血纤维蛋白可溶）
    • 球状蛋白
      • 水溶性好。
    • 膜蛋白
      • 不溶于水但可溶于去污剂aq。
  • 3、按辅基成分分类：糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白等。
  • 4、按生物学功能分类：活性蛋白质（酶、转运蛋白等）和非活性蛋白质（角蛋白、硬蛋白等）。
• （三）Pro结构和 功能的多样性
  • 蛋白质序列的多样性决定了功能的多样性。
  • ★ 功能
    • 1、催化：酶，是有机体新陈代谢的催化剂。
    • 2、调节：如激素和反式作用因子。
    • 3、转运：如血红蛋白运输氧气，载酯蛋白运输脂肪等。
    • 4、贮存：如种子蛋白和卵清蛋白。某些蛋白质的作用是储存AA作为生物体养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。
    • 5、运动：如肌肉中的肌动蛋白和肌球蛋白是运动系统的必要成分。
    • 6、结构成分：如角蛋白、胶原蛋白等可作为生物体的结构成分。
    • 7、支架作用：如锚定蛋白、连接蛋白等。
    • 8、防御和进攻：如免疫系统是机体的防御功能通过蛋白质（抗体）实现。某些生物可合成有毒的蛋白子，用于攻击或自卫。
    • 9、信息传递 ：如视觉信息的传递需要有视紫红质参与。
    • 10、遗传调控功能 ：遗传信息的储存和表达与Pro有关，如组蛋白和操纵子的阻遏诱导蛋白。
    • 11、特殊功能：如甜蛋白、胶质蛋白等
• 二、蛋白质的结构层次 （四级结构）
• 蛋白质是由多肽链折叠而成的，具有特殊的空间结构和生物学功能。蛋白质的空间结构即蛋白质的构象，指蛋白质分子所有原子在三维空间的位置。
  • 1、一级结构
    • 蛋白质多肽链中AA残基的排列顺序。
    • （缀合蛋白质的一级结构还包含共价连接的辅基部分，因此一级结构也称为共价结构/化学结构）
  • 2、二级结构
    • 肽链主链中局部肽段借助氢键形成的周期性结构，包括α 螺旋、β 折叠、β 转角、无规则卷曲等。
  • 二级和三级结构之间还存在一些过渡性的结构层次：超二级结构、结构域。
  • 3、三级结构
    • 多肽链借助非共价力折叠成具有特定走向的完整球状实体。
  • 4、四级结构
    • 具有三级结构的亚基借助非共价力彼此缔合成寡聚Pro。
• ★ 三、蛋白质的一级结构
• （一）蛋白质的AA序列决定蛋白质的功能
  • 蛋白质AA序列具有一定的可变性/柔性。在人的群体中20%～30%的Pro是多态的，即存在AA序列的变体，对Pro的功能影响很小或没有。
• （二）蛋白质一级结构举例
  • 胰岛素
    • 胰岛素分子含两条多肽链，A链（21个残基）和B链（30个残基）。这两条多肽链通过两个链间的二硫键连接起来，其中A链还有一个链内的二硫键。
• 蛋白质一级结构的测定
• （一）Pro测序的策略
  • ● 基本策略 ：片段重叠法＋氨基酸顺序直测法。
  • ● 基本步骤：① 测定Pro分子中多肽链的数目。通过测定末端AA残基的摩尔数与Pro分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
  • ② 多肽链的拆分。由多条多肽链组成的Pro分子，必需先进行拆分。可用尿素/盐酸胍处理。
  • ③ 断裂多肽链内的二硫键。在8mol / L尿素或6mol / L盐酸胍存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，并用烷基化试剂保护生成的巯基，以防其重新被氧化。
  • ④ 测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比。
  • ⑤ 分析多肽链的N-末端和C-末端。最重要的是N末端分析法（Sanger法、Edman法、DNS-Cl法、酶解法）、C末端分析法（肼解法）
  • ⑥ 多肽链断裂成多个肽段。可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其纯化。
  • ⑦ 测定各肽段的AA序列。目前常用的肽段测序方法是Edman降解法，并有序列分析仪可供利用。还有质谱法等。
  • ⑧ 重建完整多肽链的一级结构。利用两套或多套肽段的AA序列 彼此间有交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA序列。
  • ⑨ 确定二硫键的位置。一般采用胃蛋白酶断裂含二硫键的Pro样品，再利用双向电泳技术分离出各个肽段。
• （二）N-末端和C-末端AA残基的鉴定
  • 1、N-末端测序方法
    • ① DNFB（二硝基氟苯，Sanger反应）：多肽链的N端与FDNB反应生成DNF-多肽，经酸水解后，黄色的的DNF-氨基被释放，其余称为游离AA。生产的DNF-氨基经有机溶剂提取后，可用纸层析等方法进行鉴定。
    • ② DNS法（丹磺酰氯法）、达磺酰氯法———具有强烈的荧光基团，生成的衍生物更容易检出。
    • ③ PITC法（苯异硫氰酸酯法，Edman法）
    • ④ 氨肽酶法：氨肽酶是一类肽链外切酶/外肽酶，能从多肽链N端逐个向里切。根据不同的反应时间测出酶水解释放的AA种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，即可知道Pro的N端残基序列。（常见的是亮氨酸氨肽酶LAP）
  • 2、C端测序方法
    • ① 肼解法、② 还原法
    • ③ 羧肽酶法：一类肽链外切酶/外肽酶，专一地从肽链的C末端逐个降解，测定逐个释放的AA，可推断出C端残基和C端的一小段肽段的序列。【常用的羧肽酶是A、B、C、Y四种】
• （三）二硫键的断裂
  • 过甲酸氧化法、巯基化合物还原法。
• （三）AA组成的分析
  • 强酸强碱彻底降解Pro形成AA混合物，AA破坏程度与保温水解时间有线性关系，因此测定不同时间的破坏程度，通过外推法可算出AA的结构组成信息。
• （四）多肽链的部分裂解
  • 1、酶解法
    • 胰蛋白酶断裂Arg、Lys的C-末端。
    • 胰凝乳蛋白酶非专一性断裂Phe、Trp、Tyr等疏水性AA的C端。
    • 胃蛋白酶作用部位主要是芳香族AA或酸性AA的氨基所组成的肽键，断裂处Phe-Phe。
    • 木瓜蛋白酶作用于Pro中L-精氨酸、L-赖氨酸，但专一性差。
  • 2、化学裂解法
    • 溴化氢专一裂解Met的C端。
    • 羟胺法：专一性不强，在PH=9时专一裂解Asn-Gly。
• 肽段混合物的分离纯化
  • 凝胶过滤、凝胶电泳、HPLC等
• （五）肽段AA序列的测定
  • 1、Edman化学裂解法
    • 步骤：① 偶联：PITC与肽连接生成PITC-肽。 ② 环化裂解：PITC-肽在无水三氟乙酸中形成ATZ和除去一个残基的肽链。 ③ 转化：ATZ在酸性水aq中转变为PTH-氨基酸。
    • ● 常将肽链C端与不溶性树脂偶联，每轮反应只需过滤即可回收剩余肽链，以利反应循环进行。（操作程序麻烦，工作量大）
    • ● 蛋白质序列：仪灵敏度高，不仅免去了手工测定的麻烦，还满足了Pro微量序列分析的需要。
  • 2、质谱法
    • ● 通过测定样品分子裂解产生的一些碎片质量，即可获得有价值的结构信息，如肽谱/肽质量指纹图谱和肽AA序列。
    • 基本原理：
      • ① 离子源：待测样品在离子源中通过一定的方式电离。
      • ② 质量分析器：生成的荷电分子在质量分析仪中，通过磁场或其他方式作用下，按照质荷比（m/z）大小分开。
      • ③ 离子检测器：并依次冲击离子检测器，在记录仪的图纸上以峰或线的形式记录下相应m/z的位置。
  • 3、根据基因的核苷酸序列推定多肽的AA序列
• （六）肽段在原多肽链中次序的确定
  • 重叠肽：用不同的断裂方法是指断裂的专一性不同，即切口是彼此错位的，因此两套肽段正好相互跨过切口而重叠，这种跨过切口而重叠的的肽段称为重叠肽 。
  • 借助重叠肽可确定肽段在原多肽链中正确次序，进而拼凑出整个多肽链的AA序列。
• （七）二硫键位置的确定
  • 采用对角线电泳，将带检多肽部分水解成小的多肽，在纸上进行第一向电泳分离后，用过甲酸蒸汽处理，在成直角的方向进行第二向电泳。不在对角线处的出现的多肽由于含有的二硫键氧化而形成半胱氨酸残基，比原来的肽小而负电荷增加，偏离了对角线，因此可分析多肽中二硫键的位置。【肽斑可用茚三酮显色确定。将每对含磺基丙氨酸的肽段取下进行AA序列分析，然后与多肽链的AA序列比较，即可推断二硫键的位置。】
• *蛋白质数据库：PIR、PDS、MIPS、JIPIID等
• 四、氨基酸序列与生物进化
• （一）同源蛋白质AA序列的物种差异
  • ★ 同源蛋白质：在不同生物中行使相同或相似功能的Pro和具有序列同源的Pro都称为同源蛋白质。其AA有不变残基和可变残基。同源蛋白质揭示了来自任两个物种的同源蛋白质，其序列间的AA差异数目在这些物种间的系统发生差异是成比例的。
  • 同源蛋白质
    • 直向（定向进化）同源蛋白质 ：两个同源Pro来自不同物种。
    • 共生（平行进化）同源蛋白质 ：两个同源Pro是存在于同一个物种的。
  • • 不变残基 ：就某种Pro来说，对它的生物功能所必需的AA残基在整个进化过程中几乎保持不变，是保守的。
    • 可变残基 ：对Pro功能不大重要的AA残基在进化的间期可能发生改变。
  • 系统树 ：生物进化过程中，形成各种类群的系统关系，根据它们之间的亲缘进化关系绘出的熟形图。
• （二）同源Pro具有共同的进化起源
  • 丝氨酸蛋白酶 ：一个蛋白酶家族，它们的作用是断裂大分子Pro中的肽键，使之成为小分子Pro。其激活是通过活性中心一组AA残基变化实现的，它们之中一定有一个是丝氨酸。如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血因子、补体系统等。
• 血液凝固与AA序列的局部断裂
  • 机体凝血系统包括凝血和抗凝两个方面，两者间的动态平衡是正常机体维持体内血液流动状态和防止血液丢失的关键。
  • 凝血过程分为：
    • ① 内源性凝血途径 ：参加的凝血因子全部来自血液。
    • ② 外源性凝血途径 ：参加的凝血因子并非全部存在于血液中，还有外来的凝血因子参与止血。这一过程是从组织因子暴露于血液而启动，到X因子被激活的过程。
    • ③ 共同凝血途径 ：从X因子被激活至纤维Pro的形成，是内源、外源凝血的共同凝血途径。主要包括凝血酶生成和纤维Pro形成两个阶段。
• 五、肽和Pro的人工合成： 固相肽合成
  • 氨基保护基 ：叔丁氧羰基、9-芴甲氧羰基。
  • 羧基保护 ：一般用盐或酯的形式保护。【现常用的羧基活化方法：叠氮法，混合酸酐法、活化酯法。】
  • 肽键的形成需要输入能量，通常在接肽反应前把AA的羧基活化或使用缩合剂进行接肽。最有效的接肽缩合剂 ：N，N’-二环己基碳二胺（DCC）。
  • 固相肽合成（SPPS）：肽链逐步延长是在不溶性聚苯乙烯树脂颗粒上进行的。被保护的 α-氨基的AA1先共价地挂在树脂上，后除去AA1的N端保护剂，被保护了氨基的AA2以DCC为缩合剂，接到AA1残基的氨基上。重复进行，使肽链的合成顺序从C端向N端延长。
• ①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫→←↑↓ ● ★

肽，蛋白质

• 肽
• （一）肽和肽键的结构
  • ★ 肽(peptide)和蛋白质是氨基酸的线型多聚体，因此也称肽链（peptide chain)或多肽链。
  • ● 不多于20个残基的肽叫寡肽(oligoteptide)。● 多于20个残基的肽叫多肽。
  • 肽键
    • ● 蛋白质中氨基酸的基本连接方式是肽键。此外还有二硫键。
    • ★ 肽键(peptide bond)：由一个AA的α - 氨基与另一个AA的α - 羧基除去一分子水缩合而成。由于N、C原子的sp2杂化轨道，使其具有部分双键的性质。
    • 肽基 / 肽单位 ：肽键中的酰胺基（-CO-NH-）。
    • 肽键实际结构是一个共振杂化体（反式构型更稳定）。
  • ● 氨基酸残基 ：肽链中的AA由于肽键的形成已不是原来完整的分子，因此称为AA残基。
  • ● 氨基端（N端）：在一条多肽链的主链中，含有游离α - 氨基的那一末端的AA残基。 ● 羧基端（C端）：另一末端含有游离α - 羧基的AA残基称为羧基端。
    • AA序列从氨基端由左到右阅读。
• （二）肽的物理和化学性质
  • 物理
    • 肽的晶体熔点高，是离子晶格。
  • 化学
    • ①肽在水溶液中也能够带电，也有自己的等电点pI，其计算与测定同于氨基酸。（肽至少有一个游离的氨基和游离的羧基，是两性化合物，至少有2级解离，通常有多级解离。）
    • ② 肽游离的α-氨基、α-羧基、R基团的化学反应与氨基酸类似。
    • ③ 双缩脲反应：与碱性硫酸铜溶液反应，生成紫红色化合物，再借助分光光度计可测定pro的含量。【凡大于三肽的肽都能发生此反应，2肽不行；AA无此反应。】
• （三）活性肽 （具有活性的多肽）
  • 1、形成途径
    • ① 通过核糖体的途径【L型】
    • ② 不通过核糖体的酶促合成途径【D型】
  • 2、谷胱甘肽
    • 由谷氨酸、Cys、甘氨酸形成含有巯基的三肽。具有抗氧化和整合解读作用。
    • 谷胱甘肽有还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种，生理情况下GSH占多数。谷胱甘肽还原酶催化两型间的互变，该酶的辅酶为磷酸糖旁路代谢提供的NADPH。。
    • 还原性谷胱甘肽（GSH）在红细胞中作为巯基缓冲剂，维持血红蛋白或其他Pro的Cys残基处于还原态。【氧化型：GSSG】
  • 3、α-鹅膏蕈碱
    • 对动物具有致死作用：与真核生物的RNA聚合酶II进行特异性结合，抑制磷酸二酯键的形成，进而抑制RNA链合成的起始和延长。但不影响原核生物的RNA合成。
• 一、蛋白通论
• （一）蛋白质的元素组成
  • C（50%）、H（7%）、O（23%）、N（16%）、S及P、Fe等微量元素。并且在糖和脂类中不含N，可用凯氏定氮法根据样品中N的含量测定Pro含量。
  • 蛋白质含量＝蛋白质含N量×6.25
• （二）Pro的形状 / 分类
  • 1、根据组成分类
    • 单纯Pro
      • ：仅由AA组成，不含其他化学成分的Pro。
    • 缀合Pro
      • 定义：含有一定的非肽成分（金属离子、脂质、糖类等 ）的Pro，这种肽成分可松散或紧密地与多肽链结合。
      • 脱辅基蛋白质
      • 辅基（非Pro成分）
  • 2、根据形状和溶解度分类
    • 纤维状蛋白
      • 主要起结构作用，大多不溶于水/稀盐aq。（少数如血纤维蛋白可溶）
    • 球状蛋白
      • 水溶性好。
    • 膜蛋白
      • 不溶于水但可溶于去污剂aq。
  • 3、按辅基成分分类：糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白等。
  • 4、按生物学功能分类：活性蛋白质（酶、转运蛋白等）和非活性蛋白质（角蛋白、硬蛋白等）。
• （三）Pro结构和 功能的多样性
  • 蛋白质序列的多样性决定了功能的多样性。
  • ★ 功能
    • 1、催化：酶，是有机体新陈代谢的催化剂。
    • 2、调节：如激素和反式作用因子。
    • 3、转运：如血红蛋白运输氧气，载酯蛋白运输脂肪等。
    • 4、贮存：如种子蛋白和卵清蛋白。某些蛋白质的作用是储存AA作为生物体养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。
    • 5、运动：如肌肉中的肌动蛋白和肌球蛋白是运动系统的必要成分。
    • 6、结构成分：如角蛋白、胶原蛋白等可作为生物体的结构成分。
    • 7、支架作用：如锚定蛋白、连接蛋白等。
    • 8、防御和进攻：如免疫系统是机体的防御功能通过蛋白质（抗体）实现。某些生物可合成有毒的蛋白子，用于攻击或自卫。
    • 9、信息传递 ：如视觉信息的传递需要有视紫红质参与。
    • 10、遗传调控功能 ：遗传信息的储存和表达与Pro有关，如组蛋白和操纵子的阻遏诱导蛋白。
    • 11、特殊功能：如甜蛋白、胶质蛋白等
• 二、蛋白质的结构层次（四级结构）
• 蛋白质是由多肽链折叠而成的，具有特殊的空间结构和生物学功能。蛋白质的空间结构即蛋白质的构象，指蛋白质分子所有原子在三维空间的位置。
  • 1、一级结构
    • 蛋白质多肽链中AA残基的排列顺序。
    • （缀合蛋白质的一级结构还包含共价连接的辅基部分，因此一级结构也称为共价结构/化学结构）
  • 2、二级结构
    • 肽链主链中局部肽段借助氢键形成的周期性结构，包括α 螺旋、β 折叠、β 转角、无规则卷曲等。
  • 二级和三级结构之间还存在一些过渡性的结构层次：超二级结构、结构域。
  • 3、三级结构
    • 多肽链借助非共价力折叠成具有特定走向的完整球状实体。
  • 4、四级结构
    • 具有三级结构的亚基借助非共价力彼此缔合成寡聚Pro。
• ★ 三、蛋白质的一级结构
• （一）蛋白质的AA序列决定蛋白质的功能
  • 蛋白质AA序列具有一定的可变性/柔性。在人的群体中20%～30%的Pro是多态的，即存在AA序列的变体，对Pro的功能影响很小或没有。
• （二）蛋白质一级结构举例
  • 胰岛素
    • 胰岛素分子含两条多肽链，A链（21个残基）和B链（30个残基）。这两条多肽链通过两个链间的二硫键连接起来，其中A链还有一个链内的二硫键。
• 蛋白质一级结构的测定
• （一）Pro测序的策略
  • ● 基本策略 ：片段重叠法＋氨基酸顺序直测法。
  • ● 基本步骤：① 测定Pro分子中多肽链的数目。通过测定末端AA残基的摩尔数与Pro分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
  • ② 多肽链的拆分。由多条多肽链组成的Pro分子，必需先进行拆分。可用尿素/盐酸胍处理。
  • ③ 断裂多肽链内的二硫键。在8mol / L尿素或6mol / L盐酸胍存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，并用烷基化试剂保护生成的巯基，以防其重新被氧化。
  • ④ 测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比。
  • ⑤ 分析多肽链的N-末端和C-末端。最重要的是N末端分析法（Sanger法、Edman法、DNS-Cl法、酶解法）、C末端分析法（肼解法）
  • ⑥ 多肽链断裂成多个肽段。可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其纯化。
  • ⑦ 测定各肽段的AA序列。目前常用的肽段测序方法是Edman降解法，并有序列分析仪可供利用。还有质谱法等。
  • ⑧ 重建完整多肽链的一级结构。利用两套或多套肽段的AA序列 彼此间有交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA序列。
  • ⑨ 确定二硫键的位置。一般采用胃蛋白酶断裂含二硫键的Pro样品，再利用双向电泳技术分离出各个肽段。
• （二）N-末端和C-末端AA残基的鉴定
  • 1、N-末端测序方法
    • ① DNFB（二硝基氟苯，Sanger反应）：多肽链的N端与FDNB反应生成DNF-多肽，经酸水解后，黄色的的DNF-氨基被释放，其余称为游离AA。生产的DNF-氨基经有机溶剂提取后，可用纸层析等方法进行鉴定。
    • ② DNS法（丹磺酰氯法）、达磺酰氯法———具有强烈的荧光基团，生成的衍生物更容易检出。
    • ③ PITC法（苯异硫氰酸酯法，Edman法）
    • ④ 氨肽酶法：氨肽酶是一类肽链外切酶/外肽酶，能从多肽链N端逐个向里切。根据不同的反应时间测出酶水解释放的AA种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，即可知道Pro的N端残基序列。（常见的是亮氨酸氨肽酶LAP）
  • 2、C端测序方法
    • ① 肼解法、② 还原法
    • ③ 羧肽酶法：一类肽链外切酶/外肽酶，专一地从肽链的C末端逐个降解，测定逐个释放的AA，可推断出C端残基和C端的一小段肽段的序列。【常用的羧肽酶是A、B、C、Y四种】
• （三）二硫键的断裂
  • 过甲酸氧化法、巯基化合物还原法。
• （三）AA组成的分析
  • 强酸强碱彻底降解Pro形成AA混合物，AA破坏程度与保温水解时间有线性关系，因此测定不同时间的破坏程度，通过外推法可算出AA的结构组成信息。
• （四）多肽链的部分裂解
  • 1、酶解法
    • 胰蛋白酶断裂Arg、Lys的C-末端。
    • 胰凝乳蛋白酶非专一性断裂Phe、Trp、Tyr等疏水性AA的C端。
    • 胃蛋白酶作用部位主要是芳香族AA或酸性AA的氨基所组成的肽键，断裂处Phe-Phe。
    • 木瓜蛋白酶作用于Pro中L-精氨酸、L-赖氨酸，但专一性差。
  • 2、化学裂解法
    • 溴化氢专一裂解Met的C端。
    • 羟胺法：专一性不强，在PH=9时专一裂解Asn-Gly。
• 肽段混合物的分离纯化
  • 凝胶过滤、凝胶电泳、HPLC等
• （五）肽段AA序列的测定
  • 1、Edman化学裂解法
    • 步骤：① 偶联：PITC与肽连接生成PITC-肽。 ② 环化裂解：PITC-肽在无水三氟乙酸中形成ATZ和除去一个残基的肽链。 ③ 转化：ATZ在酸性水aq中转变为PTH-氨基酸。
    • ● 常将肽链C端与不溶性树脂偶联，每轮反应只需过滤即可回收剩余肽链，以利反应循环进行。（操作程序麻烦，工作量大）
    • ● 蛋白质序列：仪灵敏度高，不仅免去了手工测定的麻烦，还满足了Pro微量序列分析的需要。
  • 2、质谱法
    • ● 通过测定样品分子裂解产生的一些碎片质量，即可获得有价值的结构信息，如肽谱/肽质量指纹图谱和肽AA序列。
    • 基本原理：
      • ① 离子源：待测样品在离子源中通过一定的方式电离。
      • ② 质量分析器：生成的荷电分子在质量分析仪中，通过磁场或其他方式作用下，按照质荷比（m/z）大小分开。
      • ③ 离子检测器：并依次冲击离子检测器，在记录仪的图纸上以峰或线的形式记录下相应m/z的位置。
  • 3、根据基因的核苷酸序列推定多肽的AA序列
• （六）肽段在原多肽链中次序的确定
  • 重叠肽：用不同的断裂方法是指断裂的专一性不同，即切口是彼此错位的，因此两套肽段正好相互跨过切口而重叠，这种跨过切口而重叠的的肽段称为重叠肽 。
  • 借助重叠肽可确定肽段在原多肽链中正确次序，进而拼凑出整个多肽链的AA序列。
• （七）二硫键位置的确定
  • 采用对角线电泳，将带检多肽部分水解成小的多肽，在纸上进行第一向电泳分离后，用过甲酸蒸汽处理，在成直角的方向进行第二向电泳。不在对角线处的出现的多肽由于含有的二硫键氧化而形成半胱氨酸残基，比原来的肽小而负电荷增加，偏离了对角线，因此可分析多肽中二硫键的位置。【肽斑可用茚三酮显色确定。将每对含磺基丙氨酸的肽段取下进行AA序列分析，然后与多肽链的AA序列比较，即可推断二硫键的位置。】
• *蛋白质数据库：PIR、PDS、MIPS、JIPIID等
• 四、氨基酸序列与生物进化
• （一）同源蛋白质AA序列的物种差异
  • ★ 同源蛋白质：在不同生物中行使相同或相似功能的Pro和具有序列同源的Pro都称为同源蛋白质。其AA有不变残基和可变残基。同源蛋白质揭示了来自任两个物种的同源蛋白质，其序列间的AA差异数目在这些物种间的系统发生差异是成比例的。
  • 同源蛋白质
    • 直向（定向进化）同源蛋白质 ：两个同源Pro来自不同物种。
    • 共生（平行进化）同源蛋白质 ：两个同源Pro是存在于同一个物种的。
  • • 不变残基 ：就某种Pro来说，对它的生物功能所必需的AA残基在整个进化过程中几乎保持不变，是保守的。
    • 可变残基 ：对Pro功能不大重要的AA残基在进化的间期可能发生改变。
  • 系统树 ：生物进化过程中，形成各种类群的系统关系，根据它们之间的亲缘进化关系绘出的熟形图。
• （二）同源Pro具有共同的进化起源
  • 丝氨酸蛋白酶 ：一个蛋白酶家族，它们的作用是断裂大分子Pro中的肽键，使之成为小分子Pro。其激活是通过活性中心一组AA残基变化实现的，它们之中一定有一个是丝氨酸。如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血因子、补体系统等。
• 血液凝固与AA序列的局部断裂
  • 机体凝血系统包括凝血和抗凝两个方面，两者间的动态平衡是正常机体维持体内血液流动状态和防止血液丢失的关键。
  • 凝血过程分为：
    • ① 内源性凝血途径 ：参加的凝血因子全部来自血液。
    • ② 外源性凝血途径 ：参加的凝血因子并非全部存在于血液中，还有外来的凝血因子参与止血。这一过程是从组织因子暴露于血液而启动，到X因子被激活的过程。
    • ③ 共同凝血途径 ：从X因子被激活至纤维Pro的形成，是内源、外源凝血的共同凝血途径。主要包括凝血酶生成和纤维Pro形成两个阶段。
• 五、肽和Pro的人工合成： 固相肽合成
  • 氨基保护基 ：叔丁氧羰基、9-芴甲氧羰基。
  • 羧基保护 ：一般用盐或酯的形式保护。【现常用的羧基活化方法：叠氮法，混合酸酐法、活化酯法。】
  • 肽键的形成需要输入能量，通常在接肽反应前把AA的羧基活化或使用缩合剂进行接肽。最有效的接肽缩合剂 ：N，N’-二环己基碳二胺（DCC）。
  • 固相肽合成（SPPS）：肽链逐步延长是在不溶性聚苯乙烯树脂颗粒上进行的。被保护的 α-氨基的AA1先共价地挂在树脂上，后除去AA1的N端保护剂，被保护了氨基的AA2以DCC为缩合剂，接到AA1残基的氨基上。重复进行，使肽链的合成顺序从C端向N端延长。

肽 ， 蛋 白 质

• 肽
• （一）肽和肽键的结构
  • ★ 肽(peptide)和蛋白质是氨基酸的线型多聚体，因此也称肽链（peptide chain)或多肽链。
  • ● 不多于20个残基的肽叫寡肽(oligoteptide)。● 多于20个残基的肽叫多肽。
  • 肽键
    • ● 蛋白质中氨基酸的基本连接方式是肽键。此外还有二硫键。
    • ★ 肽键(peptide bond)：由一个AA的α - 氨基与另一个AA的α - 羧基除去一分子水缩合而成。由于N、C原子的sp2杂化轨道，使其具有部分双键的性质。
    • 肽基 / 肽单位 ：肽键中的酰胺基（-CO-NH-）。
    • 肽键实际结构是一个共振杂化体（反式构型更稳定）。
  • ● 氨基酸残基 ：肽链中的AA由于肽键的形成已不是原来完整的分子，因此称为AA残基。
  • ● 氨基端（N端）：在一条多肽链的主链中，含有游离α - 氨基的那一末端的AA残基。 ● 羧基端（C端）：另一末端含有游离α - 羧基的AA残基称为羧基端。
• （二）肽的物理和化学性质
  • 物理
    • 肽的晶体熔点高，是离子晶格。
  • 化学
    • ①肽在水溶液中也能够带电，也有自己的等电点pI，其计算与测定同于氨基酸。（肽至少有一个游离的氨基和游离的羧基，是两性化合物，至少有2级解离，通常有多级解离。）
    • ② 肽游离的α-氨基、α-羧基、R基团的化学反应与氨基酸类似。
    • ③ 双缩脲反应：与碱性硫酸铜溶液反应，生成紫红色化合物，再借助分光光度计可测定pro的含量。【凡大于三肽的肽都能发生此反应，2肽不行；AA无此反应。】
• （三）活性肽 （具有活性的多肽）
  • 1、形成途径
    • ① 通过核糖体的途径【L型】
    • ② 不通过核糖体的酶促合成途径【D型】
  • 2、谷胱甘肽
    • 由谷氨酸、Cys、甘氨酸形成含有巯基的三肽。具有抗氧化和整合解读作用。
    • 谷胱甘肽有还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种，生理情况下GSH占多数。谷胱甘肽还原酶催化两型间的互变，该酶的辅酶为磷酸糖旁路代谢提供的NADPH。。
    • 还原性谷胱甘肽（GSH）在红细胞中作为巯基缓冲剂，维持血红蛋白或其他Pro的Cys残基处于还原态。【氧化型：GSSG】
  • 3、α-鹅膏蕈碱
    • 对动物具有致死作用：与真核生物的RNA聚合酶II进行特异性结合，抑制磷酸二酯键的形成，进而抑制RNA链合成的起始和延长。但不影响原核生物的RNA合成。
• 一、蛋白通论
• （一）蛋白质的元素组成
  • C（50%）、H（7%）、O（23%）、N（16%）、S及P、Fe等微量元素。并且在糖和脂类中不含N，可用凯氏定氮法根据样品中N的含量测定Pro含量。
  • 蛋白质含量＝蛋白质含N量×6.25
• （二）Pro的形状 / 分类
  • 1、根据组成分类
    • 单纯Pro
      • ：仅由AA组成，不含其他化学成分的Pro。
    • 缀合Pro
      • 定义：含有一定的非肽成分（金属离子、脂质、糖类等 ）的Pro，这种肽成分可松散或紧密地与多肽链结合。
      • 脱辅基蛋白质
      • 辅基（非Pro成分）
  • 2、根据形状和溶解度分类
    • 纤维状蛋白
      • 主要起结构作用，大多不溶于水/稀盐aq。（少数如血纤维蛋白可溶）
    • 球状蛋白
      • 水溶性好。
    • 膜蛋白
      • 不溶于水但可溶于去污剂aq。
  • 3、按辅基成分分类：糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白等。
  • 4、按生物学功能分类：活性蛋白质（酶、转运蛋白等）和非活性蛋白质（角蛋白、硬蛋白等）。
• （三）Pro结构和 功能的多样性
  • 蛋白质序列的多样性决定了功能的多样性。
  • ★ 功能
    • 1、催化：酶，是有机体新陈代谢的催化剂。
    • 2、调节：如激素和反式作用因子。
    • 3、转运：如血红蛋白运输氧气，载酯蛋白运输脂肪等。
    • 4、贮存：如种子蛋白和卵清蛋白。某些蛋白质的作用是储存AA作为生物体养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。
    • 5、运动：如肌肉中的肌动蛋白和肌球蛋白是运动系统的必要成分。
    • 6、结构成分：如角蛋白、胶原蛋白等可作为生物体的结构成分。
    • 7、支架作用：如锚定蛋白、连接蛋白等。
    • 8、防御和进攻：如免疫系统是机体的防御功能通过蛋白质（抗体）实现。某些生物可合成有毒的蛋白子，用于攻击或自卫。
    • 9、信息传递 ：如视觉信息的传递需要有视紫红质参与。
    • 10、遗传调控功能 ：遗传信息的储存和表达与Pro有关，如组蛋白和操纵子的阻遏诱导蛋白。
    • 11、特殊功能：如甜蛋白、胶质蛋白等
• 二、蛋白质的结构层次（四级结构）
• 蛋白质是由多肽链折叠而成的，具有特殊的空间结构和生物学功能。蛋白质的空间结构即蛋白质的构象，指蛋白质分子所有原子在三维空间的位置。
  • 1、一级结构
    • 蛋白质多肽链中AA残基的排列顺序。
    • （缀合蛋白质的一级结构还包含共价连接的辅基部分，因此一级结构也称为共价结构/化学结构）
  • 2、二级结构
    • 肽链主链中局部肽段借助氢键形成的周期性结构，包括α 螺旋、β 折叠、β 转角、无规则卷曲等。
  • 二级和三级结构之间还存在一些过渡性的结构层次：超二级结构、结构域。
  • 3、三级结构
    • 多肽链借助非共价力折叠成具有特定走向的完整球状实体。
  • 4、四级结构
    • 具有三级结构的亚基借助非共价力彼此缔合成寡聚Pro。

肽，蛋白质

• ★ 三、蛋白质的一级结构
• （一）蛋白质的AA序列决定蛋白质的功能
  • 蛋白质AA序列具有一定的可变性/柔性。在人的群体中20%～30%的Pro是多态的，即存在AA序列的变体，对Pro的功能影响很小或没有。
• （二）蛋白质一级结构举例
  • 胰岛素
    • 胰岛素分子含两条多肽链，A链（21个残基）和B链（30个残基）。这两条多肽链通过两个链间的二硫键连接起来，其中A链还有一个链内的二硫键。
• 蛋白质一级结构的测定
• （一）Pro测序的策略
  • ● 基本策略 ：片段重叠法＋氨基酸顺序直测法。
  • ● 基本步骤：① 测定Pro分子中多肽链的数目。通过测定末端AA残基的摩尔数与Pro分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
  • ② 多肽链的拆分。由多条多肽链组成的Pro分子，必需先进行拆分。可用尿素/盐酸胍处理。
  • ③ 断裂多肽链内的二硫键。在8mol / L尿素或6mol / L盐酸胍存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，并用烷基化试剂保护生成的巯基，以防其重新被氧化。
  • ④ 测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比。
  • ⑤ 分析多肽链的N-末端和C-末端。最重要的是N末端分析法（Sanger法、Edman法、DNS-Cl法、酶解法）、C末端分析法（肼解法）
  • ⑥ 多肽链断裂成多个肽段。可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其纯化。
  • ⑦ 测定各肽段的AA序列。目前常用的肽段测序方法是Edman降解法，并有序列分析仪可供利用。还有质谱法等。
  • ⑧ 重建完整多肽链的一级结构。利用两套或多套肽段的AA序列 彼此间有交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA序列。
  • ⑨ 确定二硫键的位置。一般采用胃蛋白酶断裂含二硫键的Pro样品，再利用双向电泳技术分离出各个肽段。
• （二）N-末端和C-末端 AA残基的鉴定
  • 1、N-末端测序
    • ① DNFB（二硝基氟苯，Sanger反应）：多肽链的N端与FDNB反应生成DNF-多肽，经酸水解后，黄色的的DNF-氨基被释放，其余称为游离AA。生产的DNF-氨基经有机溶剂提取后，可用纸层析等方法进行鉴定。
    • ② DNS法（丹磺酰氯法）、达磺酰氯法———具有强烈的荧光基团，生成的衍生物更容易检出。
    • ③ PITC法（苯异硫氰酸酯法，Edman法）
    • ④ 氨肽酶法：氨肽酶是一类肽链外切酶/外肽酶，能从多肽链N端逐个向里切。根据不同的反应时间测出酶水解释放的AA种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，即可知道Pro的N端残基序列。（常见的是亮氨酸氨肽酶LAP）
  • 2、C端测序
    • ① 肼解法、② 还原法
    • ③ 羧肽酶法：一类肽链外切酶/外肽酶，专一地从肽链的C末端逐个降解，测定逐个释放的AA，可推断出C端残基和C端的一小段肽段的序列。【常用的羧肽酶是A、B、C、Y四种】
• （三）二硫键的断裂
  • 过甲酸氧化法、巯基化合物还原法。
• （三）AA组成的分析
  • 强酸强碱彻底降解Pro形成AA混合物，AA破坏程度与保温水解时间有线性关系，因此测定不同时间的破坏程度，通过外推法可算出AA的结构组成信息。
• （四）多肽链 的部分裂解
  • 1、酶解法
    • 胰蛋白酶断裂Arg、Lys的C-末端。
    • 胰凝乳蛋白酶非专一性断裂Phe、Trp、Tyr等疏水性AA的C端。
    • 胃蛋白酶作用部位主要是芳香族AA或酸性AA的氨基所组成的肽键，断裂处Phe-Phe。
    • 木瓜蛋白酶作用于Pro中L-精氨酸、L-赖氨酸，但专一性差。
  • 2、化学裂解法
    • 溴化氢专一裂解Met的C端。
    • 羟胺法：专一性不强，在PH=9时专一裂解Asn-Gly。
• 肽段混合物的分离纯化
  • 凝胶过滤、凝胶电泳、HPLC等
• （五）肽段 AA序列的测定
  • 1、Edman化学裂解法
    • 步骤：① 偶联：PITC与肽连接生成PITC-肽。 ② 环化裂解：PITC-肽在无水三氟乙酸中形成ATZ和除去一个残基的肽链。 ③ 转化：ATZ在酸性水aq中转变为PTH-氨基酸。
    • ● 常将肽链C端与不溶性树脂偶联，每轮反应只需过滤即可回收剩余肽链，以利反应循环进行。（操作程序麻烦，工作量大）
    • ● 蛋白质序列：仪灵敏度高，不仅免去了手工测定的麻烦，还满足了Pro微量序列分析的需要。
  • 2、质谱法
    • ● 通过测定样品分子裂解产生的一些碎片质量，即可获得有价值的结构信息，如肽谱/肽质量指纹图谱和肽AA序列。
    • 基本原理：
      • ① 离子源：待测样品在离子源中通过一定的方式电离。
      • ② 质量分析器：生成的荷电分子在质量分析仪中，通过磁场或其他方式作用下，按照质荷比（m/z）大小分开。
      • ③ 离子检测器：并依次冲击离子检测器，在记录仪的图纸上以峰或线的形式记录下相应m/z的位置。
  • 3、根据基因的核苷酸序列推定多肽的AA序列
• （六）肽段在原多肽链中次序的确定
  • 重叠肽：用不同的断裂方法是指断裂的专一性不同，即切口是彼此错位的，因此两套肽段正好相互跨过切口而重叠，这种跨过切口而重叠的的肽段称为重叠肽 。
  • 借助重叠肽可确定肽段在原多肽链中正确次序，进而拼凑出整个多肽链的AA序列。

肽 、 蛋 白 质

• （六）肽段在原多肽链中次序的确定
  • 重叠肽：用不同的断裂方法是指断裂的专一性不同，即切口是彼此错位的，因此两套肽段正好相互跨过切口而重叠，这种跨过切口而重叠的的肽段称为重叠肽 。
  • 借助重叠肽可确定肽段在原多肽链中正确次序，进而拼凑出整个多肽链的AA序列。
• （七）二硫键位置的确定
  • 采用对角线电泳，将带检多肽部分水解成小的多肽，在纸上进行第一向电泳分离后，用过甲酸蒸汽处理，在成直角的方向进行第二向电泳。不在对角线处的出现的多肽由于含有的二硫键氧化而形成半胱氨酸残基，比原来的肽小而负电荷增加，偏离了对角线，因此可分析多肽中二硫键的位置。【肽斑可用茚三酮显色确定。将每对含磺基丙氨酸的肽段取下进行AA序列分析，然后与多肽链的AA序列比较，即可推断二硫键的位置。】
• *蛋白质数据库：PIR、PDS、MIPS、JIPIID等
• 四、氨基酸序列与生物进化
• （一）同源蛋白质AA序列的物种差异
  • ★ 同源蛋白质：在不同生物中行使相同或相似功能的Pro和具有序列同源的Pro都称为同源蛋白质。其AA有不变残基和可变残基。同源蛋白质揭示了来自任两个物种的同源蛋白质，其序列间的AA差异数目在这些物种间的系统发生差异是成比例的。
  • 同源蛋白质
    • 直向（定向进化）同源蛋白质 ：两个同源Pro来自不同物种。
    • 共生（平行进化）同源蛋白质 ：两个同源Pro是存在于同一个物种的。
  • • 不变残基 ：就某种Pro来说，对它的生物功能所必需的AA残基在整个进化过程中几乎保持不变，是保守的。
    • 可变残基 ：对Pro功能不大重要的AA残基在进化的间期可能发生改变。
  • 系统树 ：生物进化过程中，形成各种类群的系统关系，根据它们之间的亲缘进化关系绘出的熟形图。
• （二）同源Pro具有共同的进化起源
  • 丝氨酸蛋白酶 ：一个蛋白酶家族，它们的作用是断裂大分子Pro中的肽键，使之成为小分子Pro。其激活是通过活性中心一组AA残基变化实现的，它们之中一定有一个是丝氨酸。如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血因子、补体系统等。
• 血液凝固与AA序列的局部断裂
  • 机体凝血系统包括凝血和抗凝两个方面，两者间的动态平衡是正常机体维持体内血液流动状态和防止血液丢失的关键。
  • 凝血过程分为：
    • ① 内源性凝血途径 ：参加的凝血因子全部来自血液。
    • ② 外源性凝血途径 ：参加的凝血因子并非全部存在于血液中，还有外来的凝血因子参与止血。这一过程是从组织因子暴露于血液而启动，到X因子被激活的过程。
    • ③ 共同凝血途径 ：从X因子被激活至纤维Pro的形成，是内源、外源凝血的共同凝血途径。主要包括凝血酶生成和纤维Pro形成两个阶段。
• 五、肽和Pro的人工合成： 固相肽合成
  • 氨基保护基 ：叔丁氧羰基、9-芴甲氧羰基。
  • 羧基保护 ：用盐或酯的形式保护。【现常用的羧基活化方法：叠氮法，混合酸酐法、活化酯法。】
  • 肽键的形成需要输入能量，通常在接肽反应前把AA的羧基活化或使用缩合剂进行接肽。最有效的接肽缩合剂 ：N，N’-二环己基碳二胺（DCC）。
  • 固相肽合成（SPPS）：肽链逐步延长是在不溶性聚苯乙烯树脂颗粒上进行的。被保护的 α-氨基的AA1先共价地挂在树脂上，后除去AA1的N端保护剂，被保护了氨基的AA2以DCC为缩合剂，接到AA1残基的氨基上。重复进行，使肽链的合成顺序从C端向N端延长。
• 蛋白质的三维结构
  • 概述
    • 蛋白质构象 ：具有相同结构式和相同构型的蛋白质分子，由于单键的旋转式键角的改变而形成的多种空间结构形态，称为蛋白质的构象。Pro分子之间构象的改变不涉及共价键的断裂。
  • 一、稳定Pro三维结构的作用力
    • 影响和稳定天然构象的化学作用力是共价二硫键和非共价（弱）相互作用。
    • 非共价相互作用 ：氢键、范德华力、离子相互作用、疏水相互作用。
  • （一）氢键
    • 多肽主链上的羰基氧和酰胺氢之间形成的氢键是稳定Pro二级结构的主要作用力。此外，还可在侧链与侧链、侧链与介质水、主链肽基与侧链/主链肽基与水之间形成。
  • （二）范德华力
    • 广义上包括三种较弱的作用力 ：定向效应、诱导效应、分散效应。
    • ① 分散效应 ：是多数情况下主要的作用的范德华力，是非极性分子/基团间仅有的一种范德华力即狭义的范德华力。这是瞬时偶极间的相互作用，偶极方向是瞬时变化的。
    • ② 定向作用 ：发生在极性分子/极性基团之间，是一种永久性的静电相互作用。
    • ③ 诱导效应 ：发生在极性与非极性物质之间，是永久偶极与其诱导出来的偶极之间的静电相互作用。
  • （三）离子相互作用（盐键/离子建）
    • 是正负电荷之间的一种静电相互作用。
    • 盐键的形成不仅是静电吸引而且也是熵增加的过程。升高温度时盐桥的稳定性增加，盐键因引入非极性溶剂而加强，加入盐类而减弱。
  • （四）疏水相互作用
    • 介质中球蛋白的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部，这一现象称为疏水相互作用，它在稳定Pro的三维结构方面占有突出地位。
    • 疏水作用其实并不是疏水基团之间有什么吸引力的缘故，而是疏水基团/疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。
    • Pro aq系统的熵增加是疏水作用的主要动力。当疏水化合物/基团进入水中时，它周围就被水分子将排列成刚性的有序结构即所谓笼形结构所包围。
  • （五）二硫键
    • 绝大多数情况下，二硫键是在多肽链的 β-转角附近形成的。
    • 二硫键的形成并不规定多肽链的折叠，然而一旦Pro采取了它的三维结构则二硫键的形成将对此构象起稳定作用。
  • 二、多肽链的空间限制
  • （一）酰胺平面和 α-碳原子的二面角
    • 两相邻酰胺平面之间，能以共同的Cα为定点而旋转。绕Cα-N 键旋转的角度称φ 角，绕C-Cα 键旋转的角度称ψ角。φ 和 ψ 称作二面角，亦称构象角。（多肽链所有可能的构象都能用φ 和 ψ两个构象角来描述。）
  • （二）拉氏构象图
    • Ramachandran根据Pro中非键合原子间的最小接触距离，确定了那些成对二面角（φ 和 ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并以φ为横坐标，ψ为纵坐标，在坐标图上画出，该构象图称为拉氏构象图。由于原子基团之间存在空间位阻，肽链构象范围是有限的。
  • 三、测定Pro三维结构的方法
  • （一）X射线衍射法
  • （二）核磁共振
  • （三）研究aq中Pro构象的光谱学方法
    • 1、紫外差光谱
    • 2、荧光与荧光偏振法
    • 3、圆二色性
  • 子主题
  • ①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫→←↑↓ ● ★αβ℃

肽 、 蛋 白 质

• （六）肽段在原多肽链中次序的确定
  • 重叠肽：用不同的断裂方法是指断裂的专一性不同，即切口是彼此错位的，因此两套肽段正好相互跨过切口而重叠，这种跨过切口而重叠的的肽段称为重叠肽 。
  • 借助重叠肽可确定肽段在原多肽链中正确次序，进而拼凑出整个多肽链的AA序列。
• （七）二硫键位置的确定
  • 采用对角线电泳，将带检多肽部分水解成小的多肽，在纸上进行第一向电泳分离后，用过甲酸蒸汽处理，在成直角的方向进行第二向电泳。不在对角线处的出现的多肽由于含有的二硫键氧化而形成半胱氨酸残基，比原来的肽小而负电荷增加，偏离了对角线，因此可分析多肽中二硫键的位置。【肽斑可用茚三酮显色确定。将每对含磺基丙氨酸的肽段取下进行AA序列分析，然后与多肽链的AA序列比较，即可推断二硫键的位置。】
• *蛋白质数据库：PIR、PDS、MIPS、JIPIID等
• 四、氨基酸序列与生物进化
• （一）同源蛋白质AA序列的物种差异
  • ★ 同源蛋白质：在不同生物中行使相同或相似功能的Pro和具有序列同源的Pro都称为同源蛋白质。其AA有不变残基和可变残基。同源蛋白质揭示了来自任两个物种的同源蛋白质，其序列间的AA差异数目在这些物种间的系统发生差异是成比例的。
  • 同源蛋白质
    • 直向（定向进化）同源蛋白质 ：两个同源Pro来自不同物种。
    • 共生（平行进化）同源蛋白质 ：两个同源Pro是存在于同一个物种的。
  • • 不变残基 ：就某种Pro来说，对它的生物功能所必需的AA残基在整个进化过程中几乎保持不变，是保守的。
    • 可变残基 ：对Pro功能不大重要的AA残基在进化的间期可能发生改变。
  • 系统树 ：生物进化过程中，形成各种类群的系统关系，根据它们之间的亲缘进化关系绘出的熟形图。
• （二）同源Pro具有共同的进化起源
  • 丝氨酸蛋白酶 ：一个蛋白酶家族，它们的作用是断裂大分子Pro中的肽键，使之成为小分子Pro。其激活是通过活性中心一组AA残基变化实现的，它们之中一定有一个是丝氨酸。如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血因子、补体系统等。
• 血液凝固与AA序列的局部断裂
  • 机体凝血系统包括凝血和抗凝两个方面，两者间的动态平衡是正常机体维持体内血液流动状态和防止血液丢失的关键。
  • 凝血过程分为：
    • ① 内源性凝血途径 ：参加的凝血因子全部来自血液。
    • ② 外源性凝血途径 ：参加的凝血因子并非全部存在于血液中，还有外来的凝血因子参与止血。这一过程是从组织因子暴露于血液而启动，到X因子被激活的过程。
    • ③ 共同凝血途径 ：从X因子被激活至纤维Pro的形成，是内源、外源凝血的共同凝血途径。主要包括凝血酶生成和纤维Pro形成两个阶段。
• 五、肽和Pro的人工合成： 固相肽合成
  • 氨基保护基 ：叔丁氧羰基、9-芴甲氧羰基。
  • 羧基保护 ：用盐或酯的形式保护。【现常用的羧基活化方法：叠氮法，混合酸酐法、活化酯法。】
  • 肽键的形成需要输入能量，通常在接肽反应前把AA的羧基活化或使用缩合剂进行接肽。最有效的接肽缩合剂 ：N，N’-二环己基碳二胺（DCC）。
  • 固相肽合成（SPPS）：肽链逐步延长是在不溶性聚苯乙烯树脂颗粒上进行的。被保护的 α-氨基的AA1先共价地挂在树脂上，后除去AA1的N端保护剂，被保护了氨基的AA2以DCC为缩合剂，接到AA1残基的氨基上。重复进行，使肽链的合成顺序从C端向N端延长。
• 蛋 白 质 的 三 维 结 构
  • 概述
    • 蛋白质构象 ：具有相同结构式和相同构型的蛋白质分子，由于单键的旋转式键角的改变而形成的多种空间结构形态，称为蛋白质的构象。Pro分子之间构象的改变不涉及共价键的断裂。
  • 一、稳定Pro三维结构的作用力
    • 影响和稳定天然构象的化学作用力是共价二硫键和非共价（弱）相互作用。
    • 非共价相互作用 ：氢键、范德华力、离子相互作用、疏水相互作用。
  • （一）氢键
    • 多肽主链上的羰基氧和酰胺氢之间形成的氢键是稳定Pro二级结构的主要作用力。此外，还可在侧链与侧链、侧链与介质水、主链肽基与侧链/主链肽基与水之间形成。
  • （二）范德华力
    • 广义上包括三种较弱的作用力 ：定向效应、诱导效应、分散效应。
    • ① 分散效应 ：是多数情况下主要的作用的范德华力，是非极性分子/基团间仅有的一种范德华力即狭义的范德华力。这是瞬时偶极间的相互作用，偶极方向是瞬时变化的。
    • ② 定向作用 ：发生在极性分子/极性基团之间，是一种永久性的静电相互作用。
    • ③ 诱导效应 ：发生在极性与非极性物质之间，是永久偶极与其诱导出来的偶极之间的静电相互作用。
  • （三）离子相互作用（盐键/离子建）
    • 是正负电荷之间的一种静电相互作用。
    • 盐键的形成不仅是静电吸引而且也是熵增加的过程。升高温度时盐桥的稳定性增加，盐键因引入非极性溶剂而加强，加入盐类而减弱。
  • （四）疏水相互作用
    • 介质中球蛋白的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部，这一现象称为疏水相互作用，它在稳定Pro的三维结构方面占有突出地位。
    • ~其实并不是疏水基团之间有什么吸引力的缘故，而是疏水基团/疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。
    • Pro aq系统的熵增加是疏水作用的主要动力。当疏水化合物/基团进入水中时，它周围就被水分子将排列成刚性的有序结构即所谓笼形结构所包围。
  • （五）二硫键
    • 绝大多数情况下，二硫键是在多肽链的 β-转角附近形成的。
    • 二硫键的形成并不规定多肽链的折叠，然而一旦Pro采取了它的三维结构则二硫键的形成将对此构象起稳定作用。