导图社区 基因工程的基本操作程序
【高中生物】基因工程的基本操作程序
【高中生物】知识点总结:基因工程的应用
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基因工程的基本操作程序
2基因表达载体的构建（核心）
目的
使目的基因在受体细胞稳定存在
使目的基因能够表达和发挥作用
条件
目的基因（例:cDNA）
启动子
位置:基因的首端
功能:rna聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录
终止子
位置:基因的尾端
功能:rna聚合酶脱离的部位，终止转录
标记基因:鉴别的筛选含有目的基因的受体细胞
3将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法
用于80％的植物，比较经济和有效
适用范围:双子叶植物，裸子植物
原理:Ti质粒上的T-DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上
原理概括
植物体受到损伤
伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物
单子叶植物无法分泌，即不能吸引农杆菌
从而吸引农杆菌移向这些细胞
农杆菌:在土壤中生活的微生物
农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA转移到受体细胞染色体的DNA上
将目的基因插入打Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入受体细胞
过程
将目的基因插入到Ti质粒上的T-DNA上
构建完表达载体后转入农杆菌
将农杆菌导入植物细胞
植物细胞:体细胞（具有全能性）
将目的基因插入到染色体的DNA上
通过【植物组织培养技术】培养再生成植株
基因枪法（微弹轰击法）
常用于单子叶植物，成本较高
原理:利用压缩气体产生的动力，将微弹打入受体细胞中
微弹:包裹着金属颗粒的表达载体DNA
花粉管通道法
简便经济
原理:在植物受粉后，花粉行成的花粉管还未愈合前，减去柱头，后滴加含目的基因的DNA，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞
实例:我国的转基因抗虫棉
将目的基因导入动物细胞
受体细胞:受精卵（不能是体细胞）
显微注射技术
操作程序:
将含目的基因的表达载体提纯
从雌性动物体内取出受精卵
并用显微注射仪进行显微注射
再将注射了目的基因的受精卵经胚胎早期培养一段时间
后移植到雌性动物的输卵管或子宫内
使其发育成为新性状的动物
将目的基因导入微生物细胞
受体细胞:原核生物
Ca离子处理法
首先用Ca离子处理细胞
为了增大细胞细胞壁的通透性
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
感受态细胞
将重组表达载体DNA分子溶于缓冲溶液中与感受态细胞混合
在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子
原核生物的特点
繁殖快
多为单细胞
遗传物质较少
容易培养
4目的基因的检测与鉴定
检测
1检测转基因生物的DNA是否插入了目的基因
【DNA分子杂交技术】
操作程序
将转基因生物的基因组DNA提取出来
全部基因
在含有目的基因的DNA片段上用【放射性同位素】等作标记
作为‘探针’
使探针与基因组DNA杂交
若显示出杂交带，则表明目的基因已插入染色体DNA中
2检测目的基因是否转录出了mRNA
【分子杂交技术】
从转基因生物中提取mRNA
全部mRNA
同样用标记的目的基因作探针
使探针与mRNA杂交
若显示出杂交带，则表明目的基因转录除了mRNA
3检测目的基因是否翻译成蛋白质
【抗原-抗体杂交法】
从转基因生物中提取蛋白质
全部蛋白质
用抗原相应的抗体进行抗原-抗体杂交
若有杂交带出现，则表明目的基因已形成蛋白质产品
鉴定
有时需要进行个体生物学水平的鉴定
1目的基因的获取
基因文库
基因组文库
（某生物体内全部DNA用限制酶变成DNA片段）
cdna文库
cDNA不含:非编码区序列（启动子，终止子）/内含子
（某生物某个时期的mRNA进行反转录成为cdna）
后都要与（运载体连接导入）成为（受体菌群体）
pcr扩增技术
原理:DNA双链复制
前提:要有一段已知目的基因的核苷酸序列（需要合成引物）
原料:dNTP（脱氧核糖三磷酸）
耐高温DNA聚合酶（5’☞3’）
引物（两种）
缓冲溶液
四种脱氧核苷酸
1（变性）模板DNA加热解旋为单链
2（复性）冷却后，引物结合到互补DNA链上
3（延伸）加热，在Taq酶的作用下，从引物起始进行互补链的合成
从5’向3’延伸
DNA合成仪（人工合成法）
前提:基因比较小，核苷酸序列已知
仪器:DNA合成仪
1已知（蛋白质的氨基酸序列）
2推测（mrna的核苷酸序列）
3推测（基因的核苷酸序列）
4化学合成获得（目的基因）
DNA半不连续复制
