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长非编码RNA Gtl2在小鼠胚胎发育早期的表达调控及功能研
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编辑于2020-06-11 08:02:57
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长非编码RNA Gtl2在小鼠胚胎发育早期的表达调控及功能研究
第一：明确Gtl2在早期胚胎的表达谱
方法：
RNA FISH
结果
在桑椹胚均匀分布，随着发育，表达向ICM聚集；囊胚时期集中表达于ICM，TE检测不到信号。
具体过程
获取小鼠胚胎
胚胎总RNA提取
逆转录
制备RNA探针
FISH
分析表达谱
第二：亚细胞定位
方法：
FISH
结果
早期桑椹胚时期：细胞质表达
早期囊胚时期：细胞质表达
方法：
印迹分析
过程及结果：
Gtl2 基因在 ICR 和 B6 小鼠外显子中的 SNP 分析
设计引物
PCR
测序
，外显子E8-E12 （primer3 扩增处）中存在两个 SNP 位点
Gtl2 在桑椹胚时期的印记分析
获取桑椹胚胎
提取总RNA
反转录
以cDNA为模板，利用先前设计的引物PCR扩增
纯化回收
测序
与NCBI中纯系B6基因组序列比对
Gtl2在桑葚胚时期即为父本印记母本表达。
暂时这个图不会看印迹分析
本章首先研究了 lncRNA Gtl2 在早期胚胎发育中的表达模式，通过 RNA FISH 实验发现，lncRNA Gtl2 在早期胚胎发育中呈动态分布，在桑椹胚 时期均匀分布于各细胞中，随着向囊胚的发育，其表达开始向内细胞团细胞中 聚集而滋养层细胞中的表达开始减弱。至扩展囊胚时期，其表达信号完全集中 于 ICM 细胞，而 TE 细胞中几乎检测不到表达信号。同时该区间另外两个 lncRNA Rian和Mirg也有类似的表达模式。这些结果说明lncRNA Gtl2和Rian、 Mirg 与 ES 细胞的发育全能性和分化有潜在的重要关系。 （2）其次对于 lncRNA Gtl2 亚细胞定位的研究发现，在早期胚胎中， lncRNA Gtl2定位于细胞质，Rian和Mirg也有相同的亚细胞定位。三个lncRNAs 一致的表达模式和亚细胞定位支持他们来自于同一转录本剪切加工的假说。 （3）对 Gtl2 的印记分析结果显示，Gtl2 自起始表达（桑椹胚）开始即为 父本印记母本表达，而此时 Gtl2-DMR 的差异甲基化尚未建立，只有 IG-DMR 一直维持父本甲基化母本非甲基化，这一结果说明 IG-DMR 是该区间印记建 立的核心调控元件。
第三：由于甲基化模式无法解释Gtl2的表达调控，因此研究了Gtl2表达前后重要位点组蛋白修饰情况
方法：
CHIP（微量样品免疫共沉淀技术）
结果：
在8细胞时期---此时Glt2不表达，有明显的抑制性组蛋白修饰H3K9me3,激活性组蛋白修饰H3K4me3较弱；在桑椹胚和囊胚期，激活性组蛋白修饰H3K4me3显著增强，H3K9me3显著减弱。
提示可能受到H3K4me3和H3K9me3协同调控
具体过程及结果：
chip检测引物设计（4对）（长度为250-300bp）
珠抗体复合物的准备
DNA 和蛋白质的交联
染色质的准备
免疫沉淀和洗涤
DNA 的纯化
qRT-PCR 及数据分析
8 细胞时期 μChIP 检测结果显示，IG-DMR 区存在 H3K9me3、H3K27me3 和 H3K4me3 组蛋白修饰的结合，其中抑制性组蛋白修饰 H3K9me3 和激活型 组蛋白修饰 H3K4me3 呈现出较强的结合； Gtl2-DMR2 区存在 H3K9me3 和 H3K4me3 组蛋白修饰的结合，且激活型组蛋白修饰 H3K4me3 的结合较强； 而 Gtl2-DMR1 和 Gtl2-DMR3 区未检测到任何明显的组蛋白修饰结合。
桑椹胚时期 μChIP 检测结果显示，IG-DMR 区同时存在激活性组蛋白修饰 H3K4me3 和抑制性组蛋白修饰 H3K9me3、H3K27me3 的结合，其中 H3K4me3 和 H3K9me3 的结合较强；Gtl2-DMR1 区存在微弱的抑制性组蛋白 H3K9me3 修饰；Gtl2-DMR2 区则同时存在激活型组蛋白修饰 H3K4me3、H3ac 和抑制性 组蛋白修饰 H3K9me3、H3K27me3； Gtl2-DMR3 区检测到抑制性组蛋白修饰 H3K9me3 和微弱的激活型组蛋白修饰 H3ac 的结合。
囊胚时期 μChIP 检测结果显示，IG-DMR 和 Gtl2-DMR2 存在较强的激活 型组蛋白 H3K4me3 的结合。
(1) 分别检测了 8 细胞时期 Gtl2 转录调控区的组蛋白修 饰结合状态，发现 IG-DMR 区同时存在较强抑制型组蛋白修饰 H3K9me3 和激 活型组蛋白修饰 H3K4me3 的结合；Gtl2-DMR2 区存在较强的激活型组蛋白修 饰 H3K4me3 的结合较强； (2) 分别检测了桑椹胚时期 Gtl2 转录调控区的组蛋白修 饰结合状态，发现IG-DMR区组蛋白修饰H3K4me3和 H3K9me3的结合较强； Gtl2-DMR1 区存在微弱的抑制性组蛋白 H3K9me3 修饰；Gtl2-DMR2 区则同时 存在激活型组蛋白修饰 H3K4me3、H3ac 和抑制性组蛋白修饰 H3K9me3、 H3K27me3； Gtl2-DMR3 区仅检测到微弱的激活型组蛋白修饰 H3ac 的结合； (3)囊胚时期 Gtl2 转录调控区的组蛋白修饰结合 状态，发现 IG-DMR 和 Gtl2-DMR2 存在较强的激活型组蛋白 H3K4me3 的结 合。组蛋白 H3K4me3 修饰结合的增强启动了 Gtl2 的表达。
第四：干细胞多能因子的调控
方法：
透明带注射法，干扰三种基因的表达
结果：
干扰后，Glt2的表达下调
表明干细胞多能因子Oct2、Sox2、Nanog对Glt2的表达有调控作用
具体方法及结果：
载体质粒的构建和包装
病毒滴度检测
将 Oct4、Sox2 和 Nanog 的 shRNA 的慢病毒颗 粒注射到受精卵的卵周隙中，使其感染受精卵
体外培养 3.5 天，收集桑椹胚和囊胚，提取总 RNA 反转录后通过 实时定量PCR方法检测Oct4、Sox2和 Nanog的干扰效率
统计各时期胚胎的数量并计算出发育率
NC 组的囊胚 发育率约 80%，桑椹胚和囊胚率约 90%；而 Oct4 干扰后，没有胚胎可以发育 到囊胚时期；Sox2 和 Nanog 实验组，虽然有部分胚胎可以发育到囊胚时期， 但大多胚胎发育停滞在桑椹胚时期和 2-8 细胞期，这说明 Oct4、Sox2 和 Nanog 的干扰对于早期胚胎的发育有较大的影响。
实时定量PCR检测Oct4、Sox2和 Nanog有效干扰后对Gtl2表达的影响
可以看出 Oct4、Sox2 和 Nanog 干扰后可以不同程度的下调 Gtl2 的表达，说明 Oct4、Sox2 和 Nanog 可以通过直接或者间接的方式调控 Gtl2 的表达。
(1) 构建并包装了 Oct4、Sox2 和 Nanog 的 shRNA 慢病毒载体，通过滴 度检测计算出所包装的病毒滴度均在 2×107 左右。（2）通过慢病毒载体透明带下注射法成功在早期胚胎发育中干扰了 Oct4、 Sox2 和 Nanog 的表达，干扰效率在 70%以上。 （3）实时定量检测 Oct4、Sox2 和 Nanog 干扰后对 Gtl2 表达的影响，发 现 Oct4、Sox2 和 Nanog 干扰后，Gtl2 的表达出现了不同程度的下调。 上述结果暗示，在早期胚胎发育过程中 Oct4、Sox2 和 Nanog 可以调控 Gtl2 的表达。
第五：Gtl2 在早期胚胎发育中的功能研究
方法：
构建Glt2的慢病毒RNA干扰载体
结果：
干扰后：不影响囊胚的发育率，但是影响囊胚后期的发育能力。
方法：
RT-PCR
结果：
干扰后：同簇基因、干细胞多能因子和分化标志蛋白的表达都出现了不同程度的下调。
提示Glt2在早期胚胎发育过程中参与了广泛的基因表达调控
具体过程及结果：
Gtl2 对胚胎发育的影响
Gtl2 干扰效率检测
lncRNA Gtl2 shRNA 的慢病毒颗粒注射到受精卵的卵周隙
体外继续培养 3.5d 后获得 shRNA-Gtl2 囊胚和 shRNA-NC囊胚
荧光显微镜下观察
体外继续培养3.5d后获得的shRNA-Gtl2囊胚；d) shRNA-NC（无效shRNA） 囊胚图；cˊ)和dˊ)分别为c)和d)的荧光视野图
PCR检测Gtl2表达量
通过单点带下注射和两点透明带下注射慢病毒，以干涉囊胚中 Gtl2 的表 达。结果发现与对照组合 sh-NC 组相比，单点和两点均能有效干扰 Gtl2 的表 达，但两点注射干扰效率更高
Gtl2 干扰后对囊胚发育率的影响
统计能够发育到桑葚胚囊胚的数量，来观察带下注射对囊胚发育率的影响。
无论注射对照 shRNA， 还是 Gtl2 的 shRNA，也无论是单点注射，还是两点注射，均不影响囊胚的发 育率，说明 Gtl2 的干扰对囊胚的早期发育能力并没有明显的影响。
Gtl2 对囊胚体外生长能力的影响
囊胚体外生长实验
收集带下注射慢病并体外发育至囊胚的胚胎
培养三天后显微镜下
囊胚体外扩 展能力和体外扩展率显著下降
Gtl2 干扰后对干细胞多能性因子的影响
Gtl2 的干扰后，干细胞多能性因子 mRNA 水平显著的下降， 表明 Gtl2 与干细胞多能性有一定的关系
Gtl2 干扰对分化标志基因表达的影响
检测了 Gtl2 干扰后对分化方向标志基因 Sox17（内胚层） 、Sox1（神经外胚层） 、brachyury（中胚层）和 cdx2（滋 养层））表达的影响
Gtl2 的干扰后，内胚层 Marker 基因 Sox17、神经外胚层 Marker 基因 Sox1、中胚层 Marker 基因 brachyury 和滋养层 Marker 基因 cdx2 表达的 影响都有不同程度的下调，表明 Gtl2 与胚胎干细胞的分化可能有一定的联系。
Gtl2 干扰后对同簇基因表达的影响
收集Gtl2干扰后的囊胚
提取总RNA并反转录
RT-PCR
观察Gtl2 干扰后对 Dlk1-Dio3 印记区间其他基因表达的影响
Gtl2 的干扰会导致 Dlk1-Dio3 印记区间其他基因表达下调， 尤其是长非编码 RNA Rian 和 Mirg，这一结果支持文献中所报道的三个长非编 码 RNA 来自于同一个转录本的观点。
(1) 通过慢病毒透明带下注射法在早期胚胎中成功降低了 Gtl2 的表达，感 染效率为 100%，同时干扰效率可以达到 60%左右； (2) Gtl2 干扰后不影响囊胚发育率，但囊胚体外生长能力显著下降，同时 导致干细胞多能性因子和干细胞分化标志蛋白表达不同程度的下调； (3) Gtl2 干扰后影响同簇基因的表达水平，对其机制进行初步研究发现， Gtl2 干扰并不影响印记调控区（IG-DMR）和其启动子区域（Gtl2-DMR）的 DNA 甲基化状态
结论：
（1）Gtl2 在胚胎着床前发育过程中的表达呈现动态分布。桑椹胚时期在 胚胎各细胞中均匀分布，随着向囊胚的发育，其表达逐渐向内细胞团聚集，在 这一发育过程中 Gtl2 始终主要在细胞质中表达，同簇的 lncRNA Rian 和 Mirg 也有相同的动态分布模式。印记分析显示，Gtl2 在初始表达的桑椹胚时期即 为父本印记母本表达。
（2）Gtl2 在桑椹胚时期表达的激活受到激活性组蛋白修饰 H3K4me3 和 抑制性组蛋白修饰 H3K9me3 的协同调控。同时，干细胞多能性因子 Oct4、Sox2 和 Nanog 对 Gtl2 的表达也具有调控作用。
（3）Gtl2的干涉虽然不影响囊胚的发育率，但却显著影响囊胚后期的发 育能力。Gtl2干扰后同簇基因、干细胞多能性因子和分化标志蛋白的表达都出 现了不同程度的下调，提示Gtl2在早期胚胎发育过程中具有潜在的重要作用。
研究内容
建立并优化全胚胎荧光原位杂交方法，即Whole mount RNA-FISH， 通过RNA FISH方法分析lncRNA Gtl2以及Rian、Mirg在着床前胚胎发育中的动态表达和亚细胞定位。并分析lncRNA Gtl2在起始表达时期即桑椹胚时期的印记状态。
建立微量样品组蛋白修饰检测方法，即μChIP，实现单次使用约2000个细胞微量样品， 对4个基因组位点进行6种组蛋白修饰或转录因子结合的平行检测。通过μChIP方法，检测早期胚胎中Gtl2表达前后各发育阶段（8细胞期、桑葚胚期和囊胚期）其转录调控区组蛋白修饰状态的动态变化，探索Gtl2 基因在早期胚胎中的表观调控机制。
建立着床前胚胎中基因干扰的方法，即shRNA慢病毒受精卵透明带下注射法。通过这种方法干扰早期胚胎中Oct4、Sox2和Nanog的表达，实时定量检测Oct4、Sox2和Nanog干扰后对lncRNA Gtl2、Rian和Mirg表达的影响。
Gtl2在胚胎着床前发育中的功能研究， shRNA慢病毒受精卵透明带下注射法干扰Gtl2在早期胚胎中的表达，并实时定量检测其干扰效率，通过检测Gtl2干扰后对囊胚发育率、囊胚发育质量、细胞凋亡和囊胚体外扩展性等分析Gtl2敲低对胚胎发育的影响，并实时定量检测Gtl2干扰对同簇基因的表达影响以及对干细胞多能性因子和一些胚胎干细胞分化的标志蛋白Marker表达的影响，研究在早期胚胎发育中的功能。
研究意义
目前的研究主要集中于胚胎中后期（着床后）发育，对于lncRNA 在胚胎早期（着床前）中的表达和功能还缺乏研究。Dlk1-Dio3 印记簇的非编码RNA与诱导多能干细胞（iPS cells）存在密切 联系，该印记簇内ncRNAs的活化程度与iPS细胞分化潜能正相关，只有他们正 确表达，iPS细胞才会具有全能发育潜能。Gtl2作为该印记区间内为重要的 lncRNA，其在着床前发育中的研究几乎还是空白，所以明确其表达模式、亚 细胞定位、表达调控机制和功能显得尤为迫切和重要。
长非编码 RNA Gtl2
特征
位置：
chr：12q
人源同系物：
位置和结构：
Meg3，定位于chr14q32.2，长度约1.6kb，基因结构分析显示：Meg3由10个外显子组成，通过可变剪接产生多种转录本。
功能：
是一种非编码抑癌基因，在许多癌症以 及肿瘤细胞系中具有抑癌功能。在多种肿瘤中，Meg3的表达受到抑制，表达水平出现明显降低或缺失。体外恢复Meg3正常表达水平可以抑制癌细胞的增殖。此外，异位表达Meg3可以抑制多种人癌细胞系的生长。Meg3在肝癌组织中表达下调，Meg3显著抑制细胞增殖，但对于细胞周期和凋亡没有显著作用。通过RNA-pulldown实验，筛选出了Meg3可能的靶基因
Meg3与p53途径、Meg3与cAMP Meg3与Rb途径 Meg3与血管生成
表达模式
Gtl2在胚胎发育中具 有时空特异性和组织特异性表达，亚细胞定位多见于细胞核。
Gtl2在小鼠E3.5 天即出现表达并且为印记表达。
实验前期的工作发现，Gtl2的表达起始于桑葚胚时期。
小鼠发育中的功能
敲除了从Gtl2-DMR到Gtl2第五外显子共10kb的区域（如下图），敲除发生在母本染色体上时，小鼠能够以正常表型出生，但存在严重的 肺泡发育不良和肝细胞坏死，并在出生后4周全部死亡；当敲除发生在父本染 色体上时，小鼠胚胎出现严重的生长迟缓，在围产期的有较高的致死率；当敲 除同时发生在父本和母本染色体上时，小鼠能够出生、存活并发育成有生育能力的成年个体。
Gtl2第一外显子到第五外显子共5kb区 域的敲除实验：母本敲除Gtl2基因导致小鼠围产期死亡并伴随着 骨骼肌发育异常，同时母本Gtl2的删除使得下游长非编码RNAs表达完全受到 抑制，并且导致这一区间印记基因表达异常和IG-DMR母本高甲基化的发生。 但是删除父本Gtl2则对小鼠胚胎发育没有影响。
另有研究表明，Gtl2位点5ˊ 端的插入突变也会造成这一区间印记丢失。
Gtl2 基因的表达调控
DNA 甲基化调控
Gtl2启动子上游的差异 基化区，即Gtl2-DMR，作为调控元件调控下游母本表达的长非编码RNA的表达，但其差异甲基化状态的建立是在胚胎E5.5天，为父本甲基化而母本非甲基化。Gtl2-DMR的作用则是在胚胎发育过程中维持Gtl2的印记表达。目前的研究已经明确了IG-DMR和Gtl2-DMR在胚胎着床前后发育中的甲基化模式，并且Gtl2在着床前胚胎中的表达不受Gtl2-DMR的调控。
组蛋白修饰调控
只有父本 IG-DMR 区检测到了抑制性组蛋白修饰H3K9me2 和H3K27me3，且分别只在桑椹胚期之后和囊胚期才能被检测到。而在4-细胞期，父、母本相应区域都检 测不到这两种抑制性组蛋白修饰。
桑、囊胚期恰恰是长非编码RNA Gtl2表达的时间窗口，提示Gtl2的表达极可能受组蛋白修饰的的调控。
干细胞多能性因子的调控
Oct4、Sox2、Nanog 和 Klf4 对长非编码 RNA 的调控 ：ES细胞中保守的长非编码RNA受Oct4和Nanog的调控
Oct4、Sox2、Nanog 和 Klf4 与 Gtl2 有类似的表达模式 ：在小鼠体内，Oct4是一种母系遗传的、进行发育调节的转录因子，在4细胞期前低表达，4细胞至桑葚胚期高表达，囊胚腔形成后，仅在内细胞团维持表达，在滋养外胚层中表达下调；Sox2在着床前与Oct4共表达；Nanog表达于桑葚胚的内部细胞，囊胚的内细胞团；而Gtl2起始表达于桑葚胚，囊胚期仅在内细胞团表达。
Oct4、Sox2 和 Klf4 在 Gtl2 启动子区域的结合：近的研究报道，在诱导形成 iPSCs 过程中，Klf4 被招募至 Gtl2 启动子 区域， Oct4、Sox2 和 Klf4 在 Gtl2 启动子区域的结合位点。
lncRNA对基因表达调控的机制
共转录调控：依赖转录过程或新生RNA的机制---与新生lincRNA转录本的相互作用或者转录调控区的转录行为调控基因的表达。
同时依赖lncRNA和转录位点的机制：衔接蛋白和染色质，通过招募蛋白或分子复合物到特异的位点实现对基因表达的顺式或反式调控。
独立于转录位点：
前两组与后一组的区别主要是，lncRNA 的靶基因位于 lncRNA 周围还是可以位于细胞内的任何地方
细胞核或胞质复合物的分子支架。
作为分子模拟物，与其二级结构模拟DNA元件，如增强子或DNA结合区域等，通过这种形式与DNA元件竞争结合蛋白等分子，从而作为模拟分子参与基因表达调控。
与其他RNA分子配对，通过与其他RNA如 mRNA 配对在转录后水平进行调控，即调控 mRNA 的降解和稳定性。
实验室早期研究
lncRNA Gtl2的表达时间：起始于8细胞时期
观察到Gtl2的甲基化模式在胚胎早期未发生变化
推测DNA甲基化不是Gtl2表达调控的主要因素。