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基因工程
概念
目的基因和载体
体外重组
引入受体细胞
增殖和表达
上游技术 基因重组、克隆和表达的设计与构建（重组DNA技术）
下游技术 涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程
目的基因的获取
A.从天然来源获取目的基因
限制修饰系统
限制系统
定义：识别、特意切割、双链DNA序列、内切核酸酶、限制异源DNA，保护自己
I型
兼具限制、修饰两种功能
特点识别，无特定切割，切割—识别400bp以上，并对识别位点随机切割
很难形成稳定的特异的切割末端，没有应用价值
II型
其限制修饰系统由两种酶组成，第二种独立的甲基化酶能修饰与限制酶识别位点相重叠的序列
特定识别序列，4—6个碱基，回文结构
特定酶切位点：识别序列的特定位点处切割双链DNA
限制性内切酶
反应关键因素（可以改动）
底物DNA的纯度和物理特性
反应系统
反应体积
孵育时间和温度
第二活性
星号活性：特异性放宽。导致因素：甘油浓度，离子强度，PH值，有机溶剂，二甲阳离子（镁离子），酶与DNA之比
保护碱基
酶切位点在末端，外侧必须还有若干个碱基内切酶才能起作用
注意事项
同裂酶
来源不同但是具有相同点识别序列的一组限制性内切核酸酶
同尾酶
一组虽然识别序列不同，单数酶切DNA分子所得的DNA片段具有相同点粘性末端的限制性内切核酸酶
特异性甲基化及星号活性
合适的酶浓度
多酶切提高效率
III型
兼具限制修饰
识别、切割特异；切割位点距识别位点3'端24－26碱基
太少，不常用
限制性核酸内切酶：是可以识别DNA特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶，它能使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断开，产生具有3'羟基和5'磷酸基团的DNA片段、有的限制性内切酶能识别两种以上的核苷酸序列
修饰系统
DNA甲基化酶
dam甲基化酶
dcm甲基化酶
甲基化酶的种类
细胞裂解酶：能参与细胞壁裂解的酶的总称
溶菌酶：裂解微生物细胞壁（分细菌、真菌）
蛋白酶K：高活性、非特异性蛋白水解酶，可水解范围广泛的肽键，可以有效的降解细胞裂解物中的DNA酶和RNA酶
B.人工合成的目的基因
寡核苷酸合成技术
脱氧核苷亚磷酰胺
受保护的3'端磷酸基团与固定在载体上的核苷酸5'末端羟基的酯化偶联一个碱基实现逐步合成
合成方向为3'---5'与酶促反应相反
PCR的
变性
94℃解链
退火
50℃，引物与模板配对
延伸
TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链
C.目的基因的分离和收集
核酸凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳
质粒用琼脂糖凝胶电泳——OC（开环——有一个磷酸二酯键断裂）最慢、线性分子中等、共价闭合环状DNA分子（cccDNA）最快
聚丙烯酰胺凝胶电泳
目的基因与载体连接
基因表达载体
载体内容（克隆载体是一个完整的复制子）
复制起点
ori（原核）
ars（真核）
多克隆位点 MCS，供外源DNA插入
标记基因
表达载体多了：（表达系统元件）：启动子，核糖体结合位点【SD序列】，转录终止子、有的好要加上真喝生物标记基因
载体
克隆载体：靶基因在宿主细胞中大量复制的载体，主要用于扩增和保存DNA片段
表达载体：靶基因在人工控制下，能在宿主细胞中主要表达RNA货蛋白质的载体
载体种类
质粒载体【一类来自细菌细胞的环装DNA分子】
染色体外能够自主复制的遗传单位
真核细胞器
细菌中染色体以外的DNA
严紧型载体，染色体复制一次，质粒复制一次
松弛型载体
在细胞中有10—200个拷贝
不相容性（不亲和性）：在无选择压力的情况下，两中携带相同或相似复制子的质粒不能共存
可转移性：自然条件下质粒能在细胞间发生转移
必须具备的条件
①高效穿梭进入细胞内，在携带目的基因之后，不影响其自身感染和进入细胞到能力和效率
②生存能力：在受体细胞内自我复制的能量，能携带目的基因在受体细胞内进行大量的复制和扩增
③要与目的基因形成充足DNA分子——多克隆位点
④要有特色标记
⑤安全性
T载体
聚合酶链反应物的克隆运载体，线性化后两侧3'各多一个碱基T(胸腺嘧啶脱氧核苷酸)
用taq酶PCR扩增的目的基因都自动带有一个凸出的A末端
病毒性载体
质粒载体的缺陷
装载目的基因的大小受到限制（小于1000个碱基对）
质粒进入细胞的方式是通过转化实现
质粒只能被转入体外培养的细胞，却不能感染在体内的动植物细胞
噬菌体，有宿主细胞特异性
基因文库的构造者
人工合成染色体
子主题
基因的拼接—DNA连接酶
DNA连接酶：依赖ATP、NAD+(细菌)水解提供的能量，
使断裂的DNA链重新接合，或使双链DNA上核苷酸之间因磷酸二酯键断裂造成的接口重新闭合（但不能连接因碱基缺失而形成的gap）
常用DNA连接酶
T4 DNA连接酶（ATP）
平末端和粘性末端均可连接，（DNA ——RNA 、RNA ——RAN）
大肠杆菌DNA连接酶（NAD+）
只能催化双链DNA粘性末端之间的连接，不能催化双链DNA平末端之间的连接
TscDNA连接酶/TaqDNA连接酶
耐热性DNA连接酶，NAD+供能，用于连接酶链式反应（PCR），扩增模板DNA，平末端和粘性末端均可
基因的改造——定点突变技术
盒式突变
PCR介导的
重组基因转入宿主细胞
确定重组载体DNA序列的正确性
DNA测序
第一代测序
化学裂解法
第二代测序
边合成边测序
第三代测序
不合成直接测序
第四代测序
直接读取核苷酸
外源基因导入宿主细胞的方法
转化
化学转化
物理转化
转染
用病毒DNA作为载体，无衣壳
转染方式
化学转染
DEAE－葡萄糖
磷酸钙法
脂质体细胞膜融合
物理转染
显微注射
电穿孔
基因抢
目的基因的检测与鉴定
目的基因是否转入宿主细胞
致死性和蓝白斑
转化成功长成白色，未重组质粒的菌落则长成蓝色
基因是否转录出了mRNA
southern印记法
目的蛋白质是否表达
SDS－PAGE电泳结合指纹测序
原则
保持核酸分子一级结构完整性【功能、结构研究的基础】
排除其他分子的污染，保证核酸纯度
末端种类
粘性末端
DNA分子在限制酶作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能通过互补碱基配对重新环化。【DNA分子（片段）经限制性内切核酸酶切产生的DNA片段末端，两条DNA链上磷酸二酯键断开的位置是交错的。DNA片段5'端比3'端长的称为5'粘性末端，反之亦然】
平末端
DNA分子（片段）经限制性内切核酸酶酶切产生的DNA片段末端，两条DNA链上磷酸二酯键断开的位置在识别序列的对称结构中心，酶切产生的末端平齐
肺炎双球菌体外转化实验、噬菌体侵染细菌实验
基因工程概述
理论基础
DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构、中心法则和遗传密码
技术突破
工具酶、载体的发现与应用、转化方法的建立
酶
活细胞产生，能在体外起催化作用的一类生物催化剂
高效性，高度专一性、可调节性和高度严格有序性、温和性、酶的易变性
影响酶催化反应的因素：酶浓度、底物浓度、PH、温度、激活剂和抑制剂
核酸酶
核酸外切酶
最终产物是dNTP
核酸内切酶
水解DNA分子链内部磷酸二酯键生成寡/寡聚核苷酸的酶
