基因工程相关知识点

高中生物选修三基因工程内容思维导图，分支内容包括：DNA重组技术的基本工具、基因工程的基本操作程序、基因工程的应用、蛋白质工程的崛起。

基因工程

• 目的基因的获取
  • 定义：目的基因主要是指编码蛋白质的金银，也可以是一些具有调控作用的因子
  • 如何判断目的基因
    • 根据基因的核苷酸序列
    • 基因的功能
    • 基因在染色体上的位置
    • 基因的转录产物mRNA
    • 基因的表达产物蛋白质
  • 方法：从基因文库中获取
    • 基因文库
      • 定义；将含有某种上午不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
      • 分类
        • 基因组文库
          • 定义：包含了一种生物的所有基因
        • 部分基因文库 （cDNA文库）
          • 定义：只包含了一种生物的部分基因
    • 扩增目的基因
      • PCR技术
        • 名称：PCR是多聚酶链式反应的缩写
        • 内容：PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术， 可以在短时间内大量扩增目的基因。
        • 原理：DNA双链复制
        • 前提：有一段已知的核苷酸序列
        • 条件
          • 有一段已知的DNA序列
          • 原料
            • 引物
            • dNTP
              • dNTP：dCTP、dATP、dGTP、dTTP）
            • Taq酶（热稳定DNA 聚合酶）
        • 过程：
          • 1.变性。目的基因DNA受热变性后解旋为单链
          • 2.复性。引物与单链相应互补序列结合
          • 3.延伸。然后在DNA聚合酶的作用下进行延伸
        • 结果：形成指数形式扩增，即2的n次方。
        • 应用
          • 感染性疾病的诊断方面
            • 例如，在新型冠状病毒肺炎疫情期间，我国研究人员在很短的时间内研制出核酸检测试剂盒，通过PCR扩增病毒的特定基因，从而实现了对疑似患者的快速检测。
      • DNA合成仪
        • 条件
          • 基因小
          • 已知核苷酸序列
        • 方法
          • DNA合成仪人工合成
• 基因表达载体的构建
  • 核心
  • 意义
    • 基因表达载体的构建是实施基因工程的第二部，也是基因工程的核心
  • 目的
    • 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的金银能够表达和发挥作用。
  • 目的基因的组成
    • 启动子
      • 一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端， 使RNA聚合酶识别和结合的部位。
      • 使目的基因表达
    • 插入基因
    • 终止子
      • 位于基因的尾端
      • 使目的基因停止表达
    • 标记基因
      • 作用
        • 鉴别受体细胞中是否含有目的基因。从而将含有这种目的基因的细胞筛选出来。
      • 种类
        • 如抗生素抗性基因
    • 复制原点
    • 图解
    • 注：由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建上也会有所差别，不可能是千篇一律的。
• 将目的基因导入受体细胞
  • 意义
    • 将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。
      • 目的基因：重组DNA分子
  • 方法
    • 植物细胞
      • 农杆菌转化法
        • 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
        • 内容
          • 将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法。 将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中的染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
            • 农杆菌： 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子也植物没有感染能力。 当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。
        • 优点
          • 使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达
          • 经济有效
      • 基因枪法（微弹轰击法）
        • 方法：利用压缩空气产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞，使目的基因与其整合并表达的方法。
        • 材料：钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6~4um
        • 适用种类：单子叶植物
        • 缺点：成本较高
      • 花粉管通道法
        • 例子：抗虫棉
        • 方法：在植物授粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头；然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
          • 此处的目的基因是重组DNA
        • 优点：简单经济
    • 动物细胞
      • 显微注射技术
        • 地位
          • 转基因动物中采用最多，也是迄今为止最为有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法
        • 过程
          • 1.将含有目的基因的表达载体提纯，并使DNA浓度保持在1~3ug/ml
          • 2.从雌性动物体内取出卵（卵可以在体内受精，也可以在体外受精），采用显微注射仪进行显微注射
          • 3.将注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养一段时间后，再移植到雌性动物的输卵管或子宫内，使其发育成为具有新性状的动物
    • 微生物细胞
      • 原核生物（例大肠杆菌）
        • 特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等
        • 转化方法
          • 钙离子处理法
            • 方法
              • 第一步，首先用钙离子处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。
              • 第二步，将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
• 目的基因的检测与鉴定
  • DNA分子层面的鉴定
    • 转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键。
    • 方法：DNA分子杂交技术
      • 过程
        • 探针：将转基因生物的基因组DNA提取出来，在目的基因的DNA片段上用放射性同位素等做标记，以此作为探针。
        • 现象：使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，就表明目的基因已经插入染色体DNA中
  • mRNA层面的鉴定
    • 需要检测目的基因是否转录出mRNA。这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。
    • 方法：分子杂交技术
      • 从转基因生物中提取的mRNA。用标记的目的基因作为探针与mRNA杂交。，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA。
  • 蛋白质层面的鉴定
    • 方法：抗原-抗体杂交
  • 个体生物水平的鉴定
    • 方法：接种实验
    • 目的：以确定是否具有抗性以及抗性的程度。 又如，有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。
• 注：PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。
• 核酸试剂盒的原理
  • 利用生物和化学原理进行工作
  • 特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物
  • 非特异性检测方法是在在PCR反应体系中，加入。过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射出荧光信号
  • 前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行