导图社区 第二十一章 毛细管电泳法
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第二十一章 毛细管电泳法
毛细管电泳仪P368
高压电源
高压电源是毛细管电泳分离系统中的重要部分,-般采用(0~ ±30)kV连续可调的直流高压电源,电压输出精度高于1%。电极通常由直径0.5~ 1mm的铂丝制成。电极槽通常是带螺帽的玻璃瓶或塑料瓶(1 ~5ml),以便于密封
毛细管柱
理想的毛细管柱应是化学和电惰性的,可以透过紫外光和可见光,有一定的韧性,易于弯曲,耐用而且经济。毛细管柱可以由聚四氟乙烯、玻璃和石英制成,目前常用的是弹性熔融石英毛细管。石英毛细管表面的金属杂质极少,不会对溶质产生非氢键吸附,表面硅羟基使毛细管内产生电渗流,也会产生氢键吸附
进样系统
压力进样(药物分析常用)
原理:将毛细管的进样端插人试样瓶中,然后使毛细管两端产生一定压差并维持一定 时间,此时试样溶液在压差作用下进入毛细管
压力进样没有组分偏向问题,进样量几乎与试样基质无关,但选择性差,组分及基质都同时被引进管中,对后续分离可能产生影响
电动进样
当把毛细管的进样端插人试样溶液并加上电场E时,组分就会因电迁移和电渗作用而进入管内
电动进样对毛细管内的填充介质没有特别限制,样品基质对电泳分离的干扰小。不过电动进样对离子组分存在进样偏向,即uap大者进样量多,反之则进样量少,这会降低分析的准确性和可靠性。另外,基质变化也会引起导电性和进样量的变化,影响进样的重现性
扩散进样
利用浓度差扩散原理将试样分子引入毛细管
扩散具有双向性,在溶质分子进人毛细管的同时,区带中的背景物质也向管外扩散,由此能抑制背景干扰,提高分离效率。扩散也与电迁移速度和方向无关,可抑制进样偏向,提高定性、定量的可靠性
检测器
紫外检测器
荧光检测器
电化学检测器
质谱检测器
毛细管电泳法基础理论P360
电渗和电渗率
电渗是一种液体相对于带电的管壁移动的现象
电泳和电泳淌度
电泳是在电场作用下带电粒子在缓冲溶液中定向移动的现象
表现淌度
分离效率和谱带展宽
理论塔板数(n)和塔板高度(H)
引起谱带展宽的因素
扩散
焦耳热
吸附
分离度(R)
毛细管电泳法的主要分离模式P363
毛细管电泳法的分类
按毛细管中的填充物质的形状分
自由溶液毛细管电泳法
非自由溶液毛细管电泳法
按分离机制分
电泳型
色谱型
电泳/色谱型
毛细管区带电泳法
分离机制
实验条件选择
分离电压
缓冲溶液的种类
缓冲溶液的选择通常需考虑下述几点
①在所选择的pH范围内有足够大的缓冲容量
②与检测器相匹配,使用紫外-可见检测器时,为减少背景干扰,缓冲溶液在检测波长处的吸收要低
③自身的淌度低,即分子大而荷电小,以减少电流的产生
④应使被测组分带合适的电荷量,以实现有效进样和有合适的电泳淌度
⑤尽可能采用酸性缓冲溶液,因在低pH条件下吸附和电渗流值都较小
⑥与毛细管种类匹配,涂层毛细管只能在一定pH范围内使用,否则会破坏涂层
缓冲溶液的浓度
缓冲溶液的pH
对于两性溶质来说,它的表观电荷数受到缓冲溶液pH的影响,在不同的pH下带不同的电荷数,因此有不同的质荷比及电荷密度,给迁移带来很大的影响
当缓冲溶液的pH低于溶质的pI时,溶质带正电,朝负极泳动,和电渗流同向,粒子迁移的总速度比电渗流还快;若缓冲溶液的pH高于溶质的pI,情况则相反
添加剂
如果缓冲体系经各种参数优化后仍无法获得良好的分离结果,可以加入添加剂以改善分离。添加剂种类较多,最简单的添加剂是无机电解质,较高浓度的电解质可以压缩区带,抑制蛋白质等在管壁上的吸附
胶束电动毛细管色谱法
胶束假固定相
在电场作用下,水相溶液由电渗流驱动流向负极,离子胶束依其电荷不同,移向正极或负极
流动相
毛细管电色谱法
分离条件选择