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高中生物 人教版 选择性必修三 第三章基因工程 详细知识点梳理，内容详实、条理清晰、易于理解，是你不可或缺的学习助手。
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基因工程
重组DNA技术的基本工具
限制性内切核酸酶
来源：从原核生物中分离纯化出来
限制酶在原核生物中的主要作用：作为防御工具切割侵入细胞的外源DNA，保证自身安全
作用：识别特定核苷酸序列，断开特定部位的磷酸二酯键
末端类型：黏性末端、平末端
举例
EcoRI：识别GAATTC，切割GA之间的磷酸二酯键并产生粘性末端
SmaI：识别CCCGGG，切割CG之间的磷酸二酯键并产生平末端
特点：特异性、专一性
DNA连接酶
作用对象：磷酸二酯键
类型
E.coli DNA连接酶
只能连接黏性末端
T4 DNA连接酶
两种末端都可连接，但连接平末端效率较低
载体
功能：将外源基因送入细胞
种类：质粒、λ噬菌体、动植物病毒
特点
有一个或多个限制酶的切割位点，供外源DNA插入
能在受体细胞中自我复制，或与受体DNA同步复制
有特殊的标记基因，便于筛选
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
方法
人工合成
前提：基因较小，核苷酸序列已知
方法：DNA合成仪
构建基因文库
基因组文库
部分基因文库（如cDNA文库：mRNA逆转录得到）
PCR
特点：特异性、快速
原料
缓冲液（含镁离子）
DNA模板
4种dNTP
脱氧核苷三磷酸，带有能量
2种引物
不可互相配对：否则出现局部碱基互补配对后失效
耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）
过程
变性：＞90℃，双链DNA解聚为单链
完全解聚，不是边解旋边复制
复性：50℃，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸：72℃，四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
有关计算
DNA分子数：2ⁿ
含有引物的DNA分子数：2ⁿ
含有其中一种引物的DNA分子数：2ⁿ-1
含有两种引物的DNA分子数：2ⁿ-2
共消耗引物的对数：2ⁿ-1
等长的DNA片段数：2ⁿ-2n
鉴定产物：琼脂糖凝胶电泳
基因表达载体的构建（核心工作）
组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因
启动子
组成型启动子：连续不断，与位置无关
组织特异性启动子：只能在特异部位表达
诱导型启动子：只能在诱导物存在时表达
“双酶切”的优点
防止目的基因和质粒环化
防止目的基因反向连接
将目的基因导入受体细胞
植物
花粉管通道法
用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
农杆菌转化法
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
特点：农杆菌细胞内含有Ti质粒，它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上
动物：显微注射法
对象：受精卵
微生物：Ca²⁺处理法
使其成为感受态
检测与鉴定
分子水平鉴定
检测是否插入目的基因或是否转录出mRNA
抗原-抗体杂交
检测是否翻译成所需蛋白质
基因工程的应用
医学：胰岛素生产、基因治疗
农业：抗虫棉、抗除草剂作物
工业：工程菌分解污染物
蛋白质工程
原理：改造基因→定向优化蛋白
流程：设计功能→修饰基因→表达
实例：长效胰岛素
