蛋白质

这是一篇关于蛋白质化学的思维导图，主要包括蛋白质的分子结构、组成与分类、氨基酸和肽三部分内容。

蛋白质

• 基本组成单位
  • 氨基酸
    • 分类
      • 是否参与蛋白质合成
        • 非蛋白质氨基酸（瓜氨酸、鸟氨酸参与尿素合成）
        • 蛋白质氨基酸（20）
          • 极性R基氨基酸
            • +：Lys Arg His
            • -：Asp Glu
            • 不带电：Gln Asn Gly Ser Thr Cys Tyr
          • 非极性R基氨基酸（8）
            • Ala Val Leu Lle Met Pro Phe Trp
    • 物理性质
      • 无色离子晶体，熔点较高，除Gly具有旋光性和立体异构，大多L型（-NH2左侧）
      • 光吸收：（20种）可见光区均无，远紫外光区(<200nm)均有，近紫外光区(220-300nm)只有Tyr Phe Trp有
      • 兼性离子，解离顺序：α-COOH,R基团-COOH,其它R基团，α-NH2，R基团-NH2
      • 等电点pI
        • 每种氨基酸都有特定pI
        • 等电点公式——pI=兼性离子两侧基团PK值和/2
      • 解离百分数计算——PH=PK'+lg[质子受体]/[质子供体]
    • 化学性质
      • α-氨基参与的反应
        • 亚硝酸-范斯来克法定量测定氨基酸
        • 甲醛-直接测定氨基酸浓度（滴定曲线）
        • 二硝基氟苯（DNFB/FDNB）-Sanger测定牛胰岛素一级结构/鉴定多肽N端氨基酸
        • 苯异硫氰酸酯（PITC）-Edman鉴定多肽N端氨基酸/氨基酸测序
        • 丹磺酰氯（DNS-Cl)-鉴定多肽N端氨基酸
        • 酰化反应-保护氨基及多肽链合成
      • α-羧基参与的反应

        • NaOH-氨基酸钠盐/醇-氨基酸乙酯的盐酸盐
      • α-氨基和羧基共同参与的反应
        • 茚三酮-紫色显色反应-氨基酸定性定量测定
      • 巯基-二硫键稳定蛋白质结构
        • 半胱氨酸-胱氨酸
        • 过甲酸/巯基乙醇/DTT（二硫苏糖醇）-打开二硫键
        • 碘乙酸-保护巯基
• 分类
  • 分子形状
    • 球状蛋白质：溶解性好，能结晶（金属蛋白酶、激素~）
    • 纤维状蛋白质
  • 组成
    • 简单蛋白质
    • 结合蛋白质（糖蛋白~）
  • 功能
    • 活性蛋白质
    • 非活性蛋白质（不具有生理活性：硬蛋白、角蛋白~）
• 结构
  • 一级结构
    • 氨基酸种类、顺序及二硫键的位置、数量
    • 氨基酸命名：从N端开始，某氨酰某氨酰--某氨基酸
    • 多肽
      • 两性性质同氨基酸（等电点公式只适用2-5肽）
      • 具有旋光性
      • 双缩脲反应-紫红色络合物-多肽定性定量测定
      • 天然存在的活性肽-鹅膏覃碱（九肽 彩色蘑菇），牛催产、加压素，脑啡肽，谷胱甘肽（血液中重要还原剂）~
    • 测定步骤
      • 1.多肽链数目——测定N端氨基酸残基的摩尔数
      • 2.肽链拆分——8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍（胰岛素不用）
      • 3.二硫键断裂——2步骤+过量β-巯基乙醇+烷基化试剂
      • 4.每条肽链氨基酸组成及氨基酸分子比——酸水解：6mol/L盐酸或4mol/L硫酸105-110°C约20h（Trp被完全破坏）/碱水解：5mol/L氢氧化钠煮沸10-20h（Trp不受破坏）
      • 5.N端测定（1）Sanger法（断开所有肽键）+乙醚 色谱法 （2）Edman法 （只断开N端肽键，依次测定，循环过程）（3）DNS-Cl （DNS具有很强荧光性，断开所有肽键）（4）（氨肽）酶降解法（时效性，酶促反应快，不现实）
      • 5'.C端测定 （1）肼解法 -NH2·NH2+苯甲醛（2）羧肽酶法（A B）
      • 6.多肽链断裂——酶解法：胰蛋白酶（Lys Arg羧基末端）胰凝乳蛋白酶（Phe Trp Tyr羧基末端）嗜热菌蛋白酶（Phe Trp Tyr Leu Lle Val氨基末端）胃蛋白酶（上两端）葡萄球菌蛋白酶（Glu Asp羧基末端）弹性蛋白酶（Ala Gly羧基末端）/——化学法：溴化氰法（Met羧基末端）
      • 7.每个肽段氨基酸顺序——Edman降解法
      • 8.肽段在短肽链位置——2套或多套肽段交错重叠
      • 9.原多肽链二硫键位置——对角线电泳法
    • 多肽链结构
      • 肽键具有部分双键性质，不能自由旋转
      • 酰胺平面（6）：肽键+相邻2个α-C原子
      • 二面角：两个相邻酰胺平面以共同α-C为定点
      • α构象限制因素：主链1/3C-N键不能旋转，α-C-N键和α-C-C键旋转受α-C上R基空间阻碍影响
  • 二级结构
    • 蛋白质主链折叠产生由氢键维系的有规则构象
    • α-螺旋（自然界多为右手）（毛发α-角蛋白、胶原蛋白）
      • 绕假想中心轴盘绕成螺旋状

      • 3.6（13）螺旋，螺距0.54nm，aa残基距离0.15nm
      • C=O N-H平行螺旋轴
      • 第一个aa残基N上H和第五个aa残基-CO的O形成氢键
      • 影响形成因素：不能形成：(1)一定PH值下，连续带同种电荷极性aa (2)Pro 羟脯氨酸-结节 （3）较大R基集中区域（Phe Trp Lle~）
    • β-折叠（反平行更稳定）（β-角蛋白：丝心蛋白）
      • 酰胺平面呈锯齿状
      • 相邻肽链通过链间氢键形成片层结构，氢键与链长轴接近垂直
      • 2aa距离：平行（6.50A）<反平行（7.0A）<完全伸展（7.23A）
      • 影响因素：R基过大，同种电荷不能形成
    • β-转角
      • 肽链回折180°，第二个aa大多Pro,第三个aa往往Gly
    • 无规卷曲
      • 松散肽链结构，不是任意的，对于每种蛋白质是特定的
      • 酶功能常常处于这种构像区域
  • 超二级结构
    • 若干相邻二级结构单元组合，彼此相互作用
    • αα：超螺旋
    • ββ：两端以上反向平行β-折叠通过β-转角连接
    • βαβ：常见三段平行β-折叠和两股α-螺旋
  • 结构域
    • 在二级或超二级基础上蛋白质三级结构内的相对独立单元，对于较小蛋白质，只有一个结构域=三级结构
    • 结构域运动：结构域之间通过松散肽键形成牢固又柔韧的连接，为较大幅度相对运动提供可能，与整体功能行使密切相关（酶分子活性中心位于结构域的铰链区，利于其活性中心结合和催化底物）
  • 三级结构
    • 次级键使二级结构相互配置
    • 紧密的球状或椭球状实体，表面空穴（活性部位），疏水侧链内部，亲水侧链外部
  • 四级结构（实质：亚基在空间排列的方式）
    • 亚基的空间排列以及亚基之间连接和结合相互作用（次级键）
    • 亚基/亚单位：具有独立三级结构的多肽链单位
    • 寡聚蛋白：有多个亚基聚集而成的蛋白质
    • 对称性
  • 维持蛋白质结构的空间作用力
    • 共价键（键能大）：肽键（一级）、二硫键、配位键（一、三级）
    • 次级键（三、四级）：离子键（盐键）、氢键（二级）、疏水键、范德华力
• 功能
  • 催化作用、控制和调节遗传物质核酸、运动作用（肌动、肌球蛋白）、运输（血红蛋白）、储存（肌红蛋白）、支持（膜蛋白）、免疫（T细胞受体）、信号传导（胰岛素、生长素）、产生特定毒性（霍乱毒素）、具有一些奇异的功能（绿色荧光蛋白）
  • 结构功能关系：一级结构决定三维结构，特定三维结构行使特定生物学功能
  • 球状蛋白质肌红蛋白Mb和血红蛋白Hb结构与功能
    • 一级结构相差大，Mb一条多肽链，Hb四条。都具有血红素辅基（原卟啉环+Fe），三维结构相似
    • Hb变构蛋白
      • 变构机理：血红素铁的微小移动导致Hb构象转换
      • 结合氧协同效应（T态——R态8个盐键断裂，又慢到快，数目越少，能量需要越少）
      • 对氧亲和性：H+、CO2促进O2释放（波尔效应）BPG（二磷酸甘油酸）促进O2释放（高山缺氧）
      • 氧合曲线 Mb 双曲 Hb S形，Hb运输氧的效率更高
• 重要性质
  • 紫外吸收
    • 远紫外区（200-230nm）较大
    • 280nm有一特征吸收峰——定性定量鉴定
      • 蛋白质质量浓度/(mg/L)=1.55 A280 -0.76A260
  • 两性性质和等电点
    • 同氨基酸
  • 胶体性质
    • 1-100nm布朗运动、光散射、电泳、不能透过半透膜、吸附能力
    • 蛋白质胶体溶液稳定原因：水膜+蛋白质带有同种电荷的双电层的相互排斥
    • 应用
      • 透析法
      • 盐溶：低浓度盐使分子分散
      • 盐析：高浓度盐
  • 沉淀反应
    • 加入适当试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层，产生沉淀
    • 方法
      • 1.调PH=pI
      • 2.盐析法：中性盐：硫酸铵、氯化钠~
      • 3.有机溶剂：丙酮、乙醇~ 夺取水化膜+分子引力加大
      • 4.重金属盐
      • 5.生物碱试剂
      • 6.抗原与特异性抗体蛋白结合沉淀
  • 变性与复性
    • 变性（一级结构未变化）
      • 变性因素及机制
        • 物：加热、紫外线、X-射线、剧烈搅拌——破坏空间结构
        • 化：酸碱——破坏盐键
        • 有机溶剂——降低介电常数，内部疏水基团暴露，静电斥力增加
        • 生物碱试剂：三氯醋酸（最常用终止酶促反应）、磷钨酸、水杨酸~——PH<pI,带正电的蛋白质结合有机酸根离子
        • 尿素/盐酸胍——破坏疏水键+竞争氢键（破坏二级结构）
        • 重金属盐——PH>pI,带负电蛋白质结合金属离子
      • 物化因素使高级构像发生变化，理化性质和生物学功能都随之改变或丧失
      • 应用
        • 变性灭菌、消毒 变性食品 制豆腐（加热大豆蛋白加盐）重金属盐中毒吃大量乳制品或蛋清（再催吐）抗衰老
      • 变性理论——吴宪
        • 生物活性丧失
        • 物理性质改变
        • 化学性质改变——暴露内部侧链基团，易与化学试剂反应
        • 生物化学性质改变——分子结构伸展松散，易被蛋白质水解酶分解
    • 复性（变性的可逆性）
      • 除去变性因素，恢复原有理化性质和生物活性
      • 前提：保持生理活性的状态=能量最低构象
  • 呈色反应
    • 双缩脲反应——红紫色络合物
    • 酚试剂反应（folin酚试剂）——褐色-蓝色
    • 茚三酮反应——紫色化合物
  • 最低分子量测蛋白质分子量
    • 假设只有一个原子/氨基酸
      • Mw=元素原子量/元素在蛋白质中百分含量
• 分离纯化
  • 分配层析
    • 固定相：固体或吸附在固体上的液体 流动相：液体或气体
    • 利用混合物各组分物化及生物学特性不同使各组分不同程度的分配在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度而最终被分离
    • 分配系数差异越大，越易被分开
      • K=物质在固定相中浓度（g/mL）/物质在流动相中的浓度（g/mL）
    • 纸层析、薄层析、柱层析
  • 吸附层析
    • 以吸附剂作为固定相，适当溶剂为流动相。利用各物质极性不同，各组分不同程度地被溶解、吸附、再溶解吸附，不同速度随流动相移动
    • 载体：硅胶 氧化铝 羟基磷石灰
  • 离子交换层析
    • 用离子交换树脂（阴阳离子）做支持剂
    • 交换反应：相同电荷—调PH值 洗脱反应：（NaCl）酸处理树脂复原
    • 应用：水处理 食品、药品制备 环境保护 合成化学和石油化学
  • 分子筛层析（凝胶层析、凝胶过滤、凝胶排阻层析）
    • 凝胶颗粒（三维网状结构：小分子物质-网孔慢 大分子物质-孔隙）——葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶
    • 应用：测定分子量、脱盐、分离提纯生物大分子
  • 亲和层析
    • 生物分子+特定固相化配基
    • 本质：次级键结合
    • 应用：纯化酶-底物、产物、抑制剂 抗原-抗体 核酸
  • 高效液相层析（HPLC）
    • 洗脱采用高压，速度快
  • 电泳
    • 带电颗粒在电场中向与其所带电荷相反的电极移动
    • 方向速度取决于电荷正负、带电荷多少、分子颗粒大小和形状
    • 电泳支持物
    • 常用电泳技术
      • 醋酸纤维薄膜电泳
      • 聚丙烯酰胺凝胶电泳
        • 一般PAGE
          • 不连续PAGE的浓缩效应
        • SDS-PAGE
          • SDS——寡聚蛋白解离成亚基，SDS结合蛋白质分子——使蛋白质分子带负电，掩饰电荷+蛋白质变性，棒球状，掩饰形状
            • Log Mr=a-bmr Mr:分子量 ab:常数 mr:迁移率
          • 电泳迁移率只取决于分子量大小
        • PAGE-等电点聚焦电泳
          • 凝胶+两性电解质载体
          • 浓集到PH=pI区域，按pI分离
      • 琼脂糖电泳