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包含β-葡聚糖是白念珠菌细胞壁表面的病原体相关分子模式、白念珠菌通过掩蔽其细胞壁中逃避宿主免疫系统的识别等等。

Cph1的激活导致白色念珠菌的ß(1,3)-葡聚糖显露，并以中性粒细胞依赖的方式减弱小鼠的毒力

背景

β-葡聚糖是白念珠菌细胞壁表面的病原体相关分子模式

为了有效地诱发疾病，白念珠菌通过掩蔽其细胞壁中的β-葡聚糖逃避宿主免疫系统的识别。

暴露葡聚糖可增加免疫系统对入侵真菌细胞的识别以增强宿主清除。

我们以前已经证明，CEK1 MAPK通路通过表达上游激酶(STE11ΔN467)的高活性等位基因而被激活，从而诱导β-葡聚糖暴露。

方法

培养基和培养条件

白念珠菌，YPD培养基，30℃，225rpm

DH5-α大肠杆菌，LB培养基，37℃

RAW264.7巨噬细胞，DMEM，37℃，5% CO2

质粒构建

菌株构建

小鼠造模

ICR小鼠

第一种免疫活性小鼠系统性感染模型

Day286 野生株+多西环素组

Day286 野生株-多西环素组

过度活跃的ste11ΔN467突变体+多西环素组

过度活跃的ste11ΔN467突变体-多西环素组

侧尾静脉注射0.1mL 1×107cells/mL菌液，感染4天后处死，取肝、肾、脾和脑组织以及外周血测定CFU和血清细胞因子

第二种免疫抑制小鼠系统性感染模型

Day286 野生株-多西环素组

过度活跃的ste11ΔN467突变体-多西环素组

侧尾静脉注射0.1mL 1×105cells/mL菌液，感染前4天开始每隔3天腹腔注射150mg/kg环磷酰胺，对照组腹腔注射PBS，感染4天后处死，取肾脏测CFU并记录小鼠每天存活率

第三种免疫抑制小鼠系统性感染模型

Day286 野生株+多西环素组

Day286 野生株-多西环素组

过度活跃的ste11ΔN467突变体+多西环素组

过度活跃的ste11ΔN467突变体-多西环素组

侧尾静脉注射0.1mL 1×105cells/mL菌液，感染前1天开始每隔2天腹腔注射300μg抗鼠Ly6G抗体（减少中性粒细胞），对照组腹腔注射PBS，感染4天后处死，取肾脏测CFU

第四种免疫抑制小鼠系统性感染模型

SC5314 野生株组

过度活跃的ste11ΔN467突变体组

cph1ΔΔ的SC5314组

过度活跃的ste11ΔN467突变体并且cph1ΔΔ组

过度活跃的ste11ΔN467突变体并且cph1ΔΔ后又回补高表达的cph1组

侧尾静脉注射0.1mL 1×107cells/mL菌液，感染4天后处死，取肾组织以及外周血测定CFU和血清细胞因子

小鼠免疫细胞耗竭

感染前4天开始每隔3天腹腔注射150mg/kg环磷酰胺

感染前1天开始每隔2天腹腔注射300μg抗鼠Ly6G抗体（减少中性粒细胞）

细胞壁成分染色和流式细胞术或显微镜分析

500μl 10μg/ml钙荧光白，37℃，5min,染总几丁质

500μl 10ug/mlWGA ,4℃，30min,染暴露几丁质

500μl 50ug/ml Alexa Fluor 647 偶联刀豆蛋白 A，4℃，30min,染甘露聚糖

血清细胞因子量化

试剂盒

TNF-α酶联免疫吸附试验

ELISA试剂盒

Western blot分析总cek1和磷酸化的cek1

结果

高活性的STE11ΔN467突变体组小鼠肾、肝、脾和脑组织CFU较其他组减少

高活性的Ste11ΔN467菌株的毒力减弱依赖于宿主免疫系统

高活性的STE11ΔN467突变体全身感染可降低小鼠的器官定植和循环细胞因子水平

免疫抑制（抑制中性粒细胞和单核细胞）后高活性的Ste11ΔN467菌株组小鼠真菌载量与野生型小鼠肾真菌载量差距约3倍比没有经过免疫抑制的鼠之间的真菌载量（差约15倍）小

免疫抑制后感染任一菌株的死亡率相似，没有免疫抑制时Ste11ΔN467菌株组小鼠的生存率高

高活性的Ste11ΔN467菌株的毒力减弱依赖于宿主免疫系统

中性粒细胞抑制后高活性的Ste11ΔN467菌株组小鼠真菌载量与野生型小鼠真菌载量差距约6倍比没有经过中细粒细胞抑制的鼠之间的肾真菌载量差（约33倍）小

中性粒细胞在清除暴露葡聚糖的的高活性的STE11/Ptet-off-STE11ΔN467菌株中发挥重要作用

高活性的Ste11ΔN467菌株细胞壁几丁质和葡聚糖含量增加

高活性的Ste11ΔN467菌株和巨噬细胞共孵育后上清中TNF-α增加

抗dectin-1抗体阻断巨噬细胞后TNF-α减少

高活性的Ste11ΔN467菌株菌丝态时暴露的葡聚糖和野生型没有差异

过度活跃的STE11ΔN467表达诱导了酵母细胞中葡聚糖和几丁质暴露的改变，并且葡聚糖是巨噬细胞诱导产生TNF-α所必须的

cek1敲除的高活性的Ste11ΔN467菌株阻断了细胞壁葡聚糖的暴露

hst7敲除的高活性的Ste11ΔN467菌株阻断了细胞壁葡聚糖的暴露

高活性的Ste11ΔN467-诱导的暴露是通过典型的Ste11-Hst7-Cek1信号转导途径介导的。

cek1的转录因子cph1敲除的高活性的Ste11ΔN467菌株阻断了细胞壁葡聚糖和几丁质的暴露以及TNF-α水平

cek1的转录因子cph1过度激活的野生型菌株可诱导细胞壁葡聚糖的暴露

cph1敲除的高活性的Ste11ΔN467菌株在系统性感染中肾真菌载量升高至野生型菌株的水平

Cek1通过转录因子Cph1诱导β(1,3)-葡聚糖暴露，并且Cph1缺失可以阻断巨噬细胞的免疫激活，恢复菌株毒性，

cph1敲除的高活性的Ste11ΔN467菌株磷酸化的cek1减少，回补cph1后又恢复至野生菌菌株的水平

opy2敲除的高活性的Ste11ΔN467菌株的细胞壁葡聚糖含量和野生型无差异

dfi1敲除的高活性的Ste11ΔN467菌株的细胞壁葡聚糖含量和TNF-α较野生型减少回补后又恢复至野生型水平，但磷酸化的cek1表达不变

Cph1在正反馈回路中发挥作用，增加MAPK上游Cek1的过度激活，cph1介导的ß(1,3)-葡聚糖的显露需要细胞壁传感器Dfi1，但Dfi1经过另一途径影响ß(1,3)-葡聚糖的显露，而不是通过Cek1的MAPK途径