TGF-β3

下图介绍了TGF-β3，通过增强DNA修复减少缺血诱导的脂肪干细胞凋亡，包含关键、内容、结论三大板块，收藏下图学习吧！

TGF-β3通过增强DNA修复减少缺血诱导的脂肪干细胞凋亡

• 关键
  • 转化生长因子 (TGF)-β3 是一种重要的细胞因子，在诱导 ADSC 中的软骨谱系分化中发挥作用 。TGF-β3 在结构和生物学上不同于 TGF-β1 和 TGF-β2 ，能够促进软骨修复和加速软骨分化。TGF-β3 是对 ADSC 分化为软骨细胞很重要的细胞因子。
• 内容
  • ADSC鉴定
    • 流式Marker
      • 阳性
        • CD29、CD44、CD105 和 CD90
      • 阴性
        • CD14(单核吞噬细胞标志物）CD34（造血细胞标志物）CD45（白细胞标志物）
    • 三系分化
      • 成脂
      • 成骨
      • 成软骨
    • 划痕实验
    • CFU集落形成分析
  • OSD凋亡验证
    • 实验对象
      • CTR
      • OD（缺氧组）-10%FBS+DMEM
      • OSD组（缺氧和血清剥夺组）-DMEM
      • OSD+TGF-β3
    • Annexin V-PI测定
      • 检测细胞凋亡
      • Annexin V
        • 正常细胞(活细胞)具有完好的细胞膜，此时细胞膜的组分之一——磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)位于细胞膜的内侧，当细胞发生凋亡时，细胞膜的结构发生改变，这使得原本在细胞膜内侧的PS外翻到细胞膜的表面，这种现象在凋亡的早期就会出现，因此就可以用与PS具有高亲和力、标记了荧光素的膜连蛋白V(Annexin V)来检测早期凋亡的细胞。
      • PI
        • 由于晚期凋亡和一些坏死的细胞也可以与Annexin V结合，因此需要引入另一种指标来将早期凋亡的细胞与之区分，这种指标就是细胞膜的通透性。与正常细胞和早期凋亡细胞不同，晚期凋亡及坏死细胞的膜通透性会增加，因此，一些原本不能进入到正常细胞内的核酸染料(如PI)便有机会进入细胞内与DNA结合。
    • TUNEL测定
      • 检测细胞凋亡
      • 基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测
    • PI检测和tunel检测结果
      • PI检测：Q2+Q3占比OSD显著高于NC、OD和OSD+tgf组，且TGF组相较OSD有显著下降
      • TUNEL阳性：同上
  • TGF-β3相关基因检测
    • 检测的基因
      • Caspase3
        • 是细胞凋亡相关的下有信号中的关键效应分子，它与其他效应半胱天冬酶（包括半胱天冬酶 7 和半胱天冬酶 6）一起通过切割特定底物来协调不同细胞结构的分解。
        • 在 NC 和 OD 组之间没有观察到 caspase 3 表达水平的显着差异，在 OSD 组，caspase 3 显着下调，活化的 caspase 3 显着上调，这表明细胞凋亡增加。与 OSD 组相比，OSD+TGF-β3 组的 caspase 3 活化显着降低。
      • Bcl-2和Bax
        • Bax 与抗凋亡蛋白 Bcl-2 形成复合物以平衡其凋亡作用
        • Bax/Bcl-2 的比率决定了细胞是否会发生凋亡
      • Caspase 9
        • 线粒体凋亡途径中的一种重要蛋白质
      • 线粒体介导的凋亡蛋白
        • OSD 条件诱导 Bax/Bcl-2 比值和半胱天冬酶 9 活化增加并且随着 TGF-β3 的添加，两者均显着降低。
      • PARP（DNA修复酶）
        • 可调节各种 DNA 损伤反应 (DDR) 过程，以确保基因组完整性并诱导 DNA 修复或细胞死亡。PARP 被活化的 caspase 3 切割，因此活化的 PARP 的变化通常与活化的 caspase 3 水平一致
    • WB结果
      • 结果
        • OD组仅活化的PARP增加，活化的Cas3没有变化（相较CTR组）；OSD组活化的PARP和活化的Cas3均增加；OSD+T组活化的Cas3降低，PARP增加。
      • 结论
        • OD组诱导细胞DDR，未出现明显凋亡；OSD诱导细胞凋亡和DDR；添加TGF可以减轻细胞凋亡，并且是通过增强PARP相关的DNA修复实现的
  • 验证PARP作用
    • Knockdown OSD组的PARP
      • WB验证
        • PARP无表达
      • 加TGF-β3处理
        • 相关蛋白变化
          • PARP ↓
          • 活化的PARP ↓
          • 活化的Cas3 ↑
        • PI结果
          • Q1+Q2阳性 ↑
      • 结论
        • 在OSD条件下，PARP抑制显着消除了TGF-β3对ADSCs的保护作用
• 结论
  • 单独的OD不会诱导ADSC凋亡，OSD（缺氧并缺FBS）可以，且TGF-β3可以通过增强PARP来减弱OSD诱导的凋亡
• doi: 10.3892/etm.2018.5980