微生物检验基础部分

临床微生物物学检验技术基础检验技术部分的整理：灭菌：高压蒸汽灭菌法：蒸汽压力103.4kpa时温度可达121.3℃，维持15～20分钟可杀死细菌繁殖体和芽孢，含糖培养基以68.95kpa，10～15分钟为宜。

细菌检验基本技术

• 观察
  • 工具：显微镜
    • 1.普通光­学显­微镜：最大0. 2um 细菌
    • 2.暗视野显微镜：常见于观察不染­色及动力情况
    • 3.荧光显微镜：细菌结构及鉴别细菌
    • 4.相差显微镜：不染色细菌形态、内部结构及运动方式
    • 5.电子显微镜
      • TEM（透视电子显微镜）：细菌病毒超维结构
      • SEM（扫描电子显微镜）：病毒细菌表面结构及附件立体图像
  • 方法
    • 不染色标本 （方法：压滴和悬滴）
      • 有动力：呈活泼有方向性运动，有明显位移
      • 无动力：原位颤动，呈不规则布朗运动
    • 染色标本
      • 染料（细菌本身在中性、碱性弱酸性带负电荷）
        • 碱性染料（带正电荷）：亚甲蓝、结晶紫、碱性复红
        • 酸性：（带负电荷不易与细菌结合，必要时降低PH使细菌带正电荷方可着色）：伊红、酸性复红，刚果红
        • 中性（碱性染料和酸性染料复合物）：瑞氏染液伊红亚甲蓝、吉姆萨染液伊红天青
      • 染色方法
        • 革兰染色：粗染（结晶紫）、媒染（碘液）、脱色（95%酒精）、复染（稀释碳酸复红）
        • 抗酸染色：结核病、麻风病
        • 荧光染色
        • 负染色
        • 其它染色
          • 荚膜染色：肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、炭疽芽孢杆菌、产气芽孢杆菌
          • 异染颗粒：白喉棒状杆菌
          • 其它
• 培养
  • 工具（培养基）
    • 主要成分
      • 概括
        • 1.营养物质：氮源、碳源、无机盐及生长因子
        • 2.水：不含杂质的蒸馏水或离子交换水
        • 3.凝固物质：①琼脂（目前最适合的凝固物质；100℃溶解45℃以下凝固）②明胶
      • 常见营养物质概述
        • 蛋白胨：提供氮源
        • 肉浸液：提供氮源和碳源（制作培养基时需加入1%～2%蛋白胨和0.5%Nacl）
        • 牛肉膏：碳源（因无糖，可作为肠道细菌的鉴别培养基的基础成分）
        • 血液
        • 鸡蛋和血清：结核分支杆菌鸡蛋培养基、白喉棒状杆菌吕氏培养基
        • 无机盐
        • 生长因子：流感嗜血杆菌（X因子和V因子）
        • 糖（醇）类：碳源
    • 分类
      • 用途
        • 基础培养基：肉浸液（肉汤）、普通琼脂平板
        • 营养培养基：血琼脂平板、巧克力色琼脂平板
        • 选择培养基：SS琼脂平板（胆盐抑制革兰阳性菌、枸橼酸钠和煌绿抑大肠埃希菌从而有利于沙门、志贺菌分离）
        • 鉴别培养基：SS琼脂、伊红美蓝（EMB）琼脂、麦康凯（MAC）琼脂
        • 特殊培养基：厌氧培养基、细菌L型培养基（高渗低琼脂培养基）
      • 物理性状
        • 液体培养基（最常用肉汤）：增菌或纯种细菌生长现象观察
        • 半固体培养基（液体+0.3%～0.5%琼脂）：细菌动力和保存菌种
        • 固体培养基（1.5%～2.0%琼脂）：细菌分离纯化、药敏、鉴定
    • 制备
      • 调配
      • 溶解
      • 校正PH：一般调至7.2～7.6
      • 分装（不宜超过2/3）
        • 液体培养基：1/4～1/3
        • 半固体：1/3
        • 琼脂斜面：2/3
        • 琼脂高层：1/3
        • 琼脂平板：高压蒸汽灭菌冷却至50～60℃时倾注到平板，平板4℃保存备用，新制成平板置35℃温箱30分钟后使用
      • 灭菌：高压蒸汽灭菌法：蒸汽压力103.4kpa时温度可达121.3℃，维持15～20分钟可杀死细菌繁殖体和芽孢，含糖培养基以68.95kpa，10～15分钟为宜
      • 质量检验：①无菌实验：灭菌培养基35℃温箱培养过夜，判断灭菌效果 ②效果检验：按不同培养要求接种培养
      • 保存：冷暗处或4℃冰箱，一般不超过7天
  • 人工培养：
    • 无菌技术
      • 概念：防止微生物进入物品或机体，同时防止带检物中可能存在的病原微生物污染周围环境及工作人员的规范化操作技术。无菌技术是保证细菌检验质量，防止污染和病原菌扩散的基础。
      • 无菌室：在使用前用紫外线灯照射30分钟至1小时或使用5%苯酚或10%苏水喷雾消毒
    • 细菌接种分离方法
      • 平板划线法
        • 连续划线分离法：主要用于杂菌不多的标本
        • 分区划线分离法：适用于杂菌量较多的标本
      • 琼脂斜面接种法：纯种增菌，保存菌种（从下向上划线）
      • 液体接种法：用于肉汤、蛋白胨水及糖发酵管液体培养基接种（避免接种环与液体过多接触，更不能在液体中搅拌，以免形成气溶胶，造成实验室污染）
      • 穿刺接种法：用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种
      • 涂布接种法：用于纸片药物敏感试验，也可用于细菌计数
      • 倾注平板法：本法用于兼性厌氧或厌氧菌的稀释定量培养和饮水、饮料、牛乳及尿液等标本的活菌计数
    • 细菌生长现象
      • 固体
        • 菌落描述
          • 大小（mm）
          • 形状（露滴、圆形、菜花形、不规则）
          • 凸起、扁平、凹陷
          • 边缘（光滑、波形、锯齿形、卷发形）
          • 透明度（不透明、半透明、透明）
          • 颜色
          • 表面（光滑、粗糙）
          • 粘度
        • 三类菌落
          • 光滑型（S型）：光滑、湿润及边缘整齐（新分离细菌大多呈光滑型）
          • 粗糙型（R型）：表面粗糙、干燥、呈皱纹状或颗粒状，边缘大多不整齐（炭疽芽孢杆菌、结核分支杆菌新分离即是）
          • 粘液型（M型）：粘稠有光泽（多有厚荚膜或丰富粘液层，如肺炎可雷伯菌）
      • 液体
        • 混浊生长
        • 沉淀生长
        • 表面生长
      • 半固体
        • 动力实验阳性（有鞭毛）：沿穿刺线生长，且在穿刺线两侧可见羽毛状或云雾状混浊生长
        • 动力试验阴性（无鞭毛）：沿穿刺线线状生长，穿刺线两边澄清透明
• 鉴定
  • 碳水化合物代谢试验
    • 糖（醇、苷）类试验
      • 原理：不同细菌含不同发酵糖醇苷的酶，有的仅仅产酸，有的产酸产气
    • 氧化发酵试验（O-F试验）
      • 原理：分解葡萄糖是非需要氧气参与
      • 分类鉴别
        • 氧化型（专型需氧）只在有氧环境分解葡萄糖
        • 发酵型（兼性厌氧）有氧无氧都分解
        • 产碱型 不分解
    • 阝-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
      • 原理：有些细菌产生半乳糖苷酶分解邻-硝基酚-阝-D-半乳糖苷（ONPG），ONPG无色水解后变黄色硝基酚
    • 七叶苷水解试验
      • 原理：有些细菌能水解七叶苷生成葡萄糖和七叶素（七叶素与培养基二价铁离子或铅离子结合形成黑色化合物）培养基呈黑色
    • 甲基红（MR）试验：
      • 原理：细菌分解葡萄，产物使得培养基ph下降
      • 鉴别
        • 分解葡萄糖为丙酮酸，进一步将丙酮酸代谢为乳酸、乙酸、甲酸，ph下降至4.5以下，加甲基红呈红色该实验阳性
        • 分解葡萄糖产酸少或产酸转变为醇酮醛气体和水，ph维持至6.2以上，加甲基红呈黄色该实验阴性
    • VP试验
      • 原理细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气氧化为二乙酰（丁二醇），二乙酰与培养基精氨酸含的胍基结合形成红色化合物，vp试验阳性

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