导图社区 核酸的理化性质及研究方法知识点总结
核酸的理化性质及研究方法知识点总结：核酸的理化性质：变性引起的核酸理化性质的改变：DNA生物学功能不变、浮力密度增大。
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核酸的理化性质及研究方法知识点总结
核酸的理化性质
紫外吸收
最大吸收峰
260nm
紫外吸收的结构
碱基
核酸的紫外吸收值比蛋白质大得多
核酸的碱基多得多
酸碱解离
pI一般较低
含有大量磷酸基团
DNA
4-4.5
RNA
2-2.5
黏度
结构细长并具有一定刚性
DNA黏度非常高
沉淀
一定的盐浓度下，沉淀水相中的核酸
2.5-3倍体积的无水乙醇
RNA可用异丙醇代替
盐的作用
中和磷酸基团所带的负电荷
无水乙醇的作用
降低溶液的极性，有利于阳离子与磷酸基团的结合
变性
定义
双螺旋的解链
不涉及共价键的断裂
导致核酸变性的因素
破坏稳定双螺旋构象的因素及增强不利于双螺旋稳定的因素
加热
碱性pH
促进互变异构的发生
* 破坏氢键
低离子强度
降低对磷酸负电荷的中和
有机试剂
甲醛
甲醇
乙醇
尿素
甲酰胺
破坏疏水作用力
破坏氢键
常用的DNA变性方法
热变性
碱变性
变性引起的核酸理化性质的改变
紫外吸收增加
称为增色效应
检测核酸变性的重要指标
常以紫外吸收为纵坐标作图
碱基堆积力会降低紫外吸收
变性后碱基堆积力被削弱
浮力密度增大
几种生物大分子的密度
蛋白质<DNA<RNA
* RNA密度大的原因 * RNA含有2'-OH * 单链RNA通常会自我折叠成更致密的结构
增大原因
解螺旋后，DNA单链会像RNA一样折叠成更致密的结构
溶液黏度降低
原因
DNA会折叠成更小更致密的结构
旋光性变化
DNA分子局部的对称性及分子局部的构象改变
DNA生物学功能不变
一级结构没有破坏
解链有助于DNA行使其生物学功能
RNA的生物学功能取决于具体情况
DNA的“熔点”Tm
DNA双螺旋有一半发生热变性或有一半氢键被破坏时的温度
DNA的变性曲线通常为S形
存在正协同效应
一旦开始解链，解链处周边的氢键会更容易断裂
影响Tm值的因素
DNA的均一性
DNA序列的均一性
* 序列均一性越高，Tm值范围越窄
样品DNA的组成均一性
* 组成均一性越高，Tm值范围越窄
GC含量
GC含量越高
* Tm值越高
离子强度
离子强度越高
双螺旋的长度
双螺旋越长
其他因素
降低DNA稳定性的试剂
特异性与单链DNA或双链DNA结合的蛋白
RNA的Tm
双螺旋的RNA
Tm与DNA相似
其他RNA
Tm值较低，变性曲线较宽
复性
退火
热变性DNA的冷却复性
核酸变性一般可逆
复性同样存在正协同效应
影响DNA复性的因素
温度
低于Tm值25℃最佳
复性时温度的下降需缓慢进行
DNA浓度
DNA序列的复杂度或均一性
序列均一性越高
复性越容易
Cot
复性速率与DNA序列复杂度的关系
Co：单链DNA的起始浓度
t：以s为单位的时间
Cot1/2
标准条件下测得的复性率达1/2时的Cot值
与DNA序列复杂度呈正比
对原核生物
代表它们基因组大小及基因组中碱基序列的复杂度
对真核生物
Cot曲线由若干个S形曲线叠加而成
* 基因组中含有许多不同程度的重复序列
意义
可用来测定某种生物基因组的大小和特征以及重复序列的拷贝数
杂交
核酸的水解
酸碱水解
DNA怕酸不怕碱
酸性条件下DNA会自发脱嘌呤
体内DNA会存在自发损伤
DNA常保存于弱碱
RNA怕碱不怕酸
碱性条件下2'-OH亲核性更强
RNA常保存于弱酸
极酸会导致水解
极碱会先变性，后水解
酶促水解
核酸酶
分类
DNA酶
RNA酶
磷酸二酯酶
* 即可水解DNA，又可水解RNA
重要的核酸酶
核糖核酸酶H（RNase H）
* 专门水解与DNA形成杂交双螺旋的RNA * 应用 * 可用于定向水解细胞内特定的mRNA * 只要合成一小段DNA探针即可
核酸酶S1
* 专门水解单链核酸 * 在发夹结构中 * 水解环的部分 * 应用 * cDNA合成 * 合成步骤 * 获取mRNA * 逆转录得单链cDNA * 除去mRNA * 碱性环境 * 使用RNase H * 制取双链cDNA * 单链cDNA的3'端会自动折叠形成小发夹结构 * 以小发夹结构为起点，合成互补链 * 用核酸酶S1除去发夹结构的环 * 获得双链cDNA
限制性内切酶
* 具有序列特异性 * 产生 * 平末端 * 黏末端
核酸研究的技术和方法
核酸的化学合成
化学合成相较于生物合成的优点
不受序列和结构的限制
在合成中可直接引入修饰的碱基、修饰的戊糖或修饰的戊糖-磷酸骨架
提高特异性、碱基配对的稳定性
原理
与多肽的化学合成相似
对核苷酸单体上的活性基团进行保护或去保护
对成键基团进行活化
固相合成法
基本步骤
起始原料的制备
偶联
去保护
核酸的分离、纯化和定量
核酸的抽取
两种核蛋白的分离
核酸在细胞内的存在形式
核糖核蛋白
脱氧核蛋白
去除原理
两种核蛋白在不同盐浓度下溶解度存在差别
核糖核蛋白的抽取
* 0.14mol/L NaCl
脱氧核蛋白的抽取
* 1mol/L NaCl
蛋白质的去除
先用DNA/RNA酶除去另一种核酸
除去蛋白质的方法
蛋白酶K的消化
酚/氯仿的多次抽取
* 核酸溶解在上层水相 * 蛋白质变性后处于两相的界面
核酸的沉淀
可在一定盐浓度下，用2.5-3倍体积的冷无水乙醇沉淀
纯化RNA尤其mRNA时需格外小心其降解
电泳
核酸带有负电荷
含大量磷酸基团
电泳方法
琼脂糖凝胶电泳
用溴乙锭染色检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳
使用最多
用放射自显影或银染检测
分离方法
核酸分子的大小
离心
收集沉淀的DNA
进一步纯化核酸
测定一种DNA分子中的GC含量
常用密度梯度离心分离
层析
阴离子交换层析
分离制备核酸
羟基磷灰石
分离单链DNA和双链DNA
寡聚dT亲和层析
分离带有多聚腺苷酸尾的真核生物mRNA
核酸的纯度的检测和定量
紫外分光光度法
测定OD260/OD280推算纯度
DNA比值>1.8纯度较高
RNA比值1.9-2.0纯度较高
核酸一级结构的测定
DNA一级结构的测定
第一代DNA测序
双脱氧法（末端终止法，Sanger法）
材料
* 酶 * 经过基因工程改造过的T7噬菌体DNA聚合酶 * 引物 * 人工合成的寡聚脱氧核苷酸（放射性同位素标记）
操作
* 进行四组平行的反应 * 相同的模板、相同的引物、四种dNTP * 每组反应中各加入一种适量的2',3'-双脱氧核苷酸（ddNTP） * 将随机参入DNA链中 * 因缺乏3'-OH，一旦进入DNA链，将导致DNA链合成的末端终止 * 产生相应的4组具有特定长度的、不同长短的DNA片段 * 将4组DNA片段经过聚丙烯酰胺凝胶电泳 * 按链的长算分开 * 经过放射自显影技术 * 自上而下直接读出被测DNA的核苷酸序列
碱基特异性化学断裂法（化学断裂法、Maxam-Gilbert法）
* 用特殊的化学试剂处理待测的已在一侧末端被放射性同位素标记的双链DNA * 造成其特定碱基的修饰、脱落和戊糖-磷酸骨架被特异性切割 * 产生一组长度不同的DNA链裂解产物 * 再用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和放射自显影观察 * 可直接读出DNA片段的核苷酸序列
碱基修饰试剂
* 硫酸二甲酯（DMS） * 针对A或A+G * 肼 * 针对C或C+T
步骤
* 需要进行4组平行反应 * G特异性反应 * 碱性条件下 * G受DMS作用，N7甲基化 * 糖苷键变得不稳定 * 经哌啶作用 * 嘌呤环打开并脱落 * 与无G的脱氧核糖环相连的磷酸二酯键断裂 * 每遇到一个G就产生两个DNA片段，但只有一个片段带同位素标记 * 嘌呤碱基特异性的反应 * 先对DNA进行酸处理，再加DMS * DNA链在G的N7和A的N3都发生甲基化 * 后续处理同G特异性反应 * 每遇到一个嘌呤碱基就会产生两个片段，只有一个片段带同位素标记 * 嘧啶碱基特异性的反应 * 在肼作用下 * DNA链上的嘧啶环发生水解而打开 * 受哌啶的作用 * 嘧啶脱落 * 裸露的脱氧核糖碱基被修饰，发生β-消去反应 * 与无嘧啶的脱氧核糖环相连的两个磷酸二酯键断裂 * 每逢嘧啶碱基就产生两个片段，只有一个片段带有同位素标记 * C特异性的反应 * 高盐浓度下，按嘧啶碱基特异性的反应方法处理DNA * T被保护，只有C才会发生反应 * 每逢C产生两个片段，只有一个片段带有同位素标记 * 聚丙烯酰胺凝胶电泳+放射自显影 * 自上而下读出DNA序列
较末端终止法的优缺点
* 测定出来的序列直接来自原DNA分子，而非经酶促合成产生的新拷贝 * 可对人工合成的DNA进行测序 * 可以分析天然DNA原来可能含有的修饰碱基 * 可以结合蛋白质保护及修饰干扰实验，测定一个DNA分子上一段特殊的碱基序列 * 末端终止法简单快速，试剂毒性低，仍是测序首选
DNA序列分析的自动化
基于双脱氧法的DNA序列自动分析
* 将不同荧光标记的DNA引物引入到测序反应中 * 步骤 * 按照标准的末端终止法进行测序反应 * 将四组反应混合物合并 * 在同一块凝胶的同一个泳道进行电泳 * 随电泳进行，各寡核苷酸片段从小到大依次通过凝胶底部 * 受激光器发生的激光束的激发，每一个寡核苷酸片段在5'端的荧光标记发出荧光 * 不同颜色的荧光代表不同的核苷酸
第二代DNA测序
典型标志
使用大规模并行的方法
* 大量样品在同一个仪器内同时测定
方法
454 Life Science 焦磷酸测序
* 原理 * 将DNA切成几百个碱基长的单链片段 * 每一个片段被固定在小珠子上 * 使用PCR进行扩增 * 使每一个珠子上带有许多相同拷贝的DNA * 使用微型机器人，将珠子放到含有百万微孔的光纤平板上 * 与双脱氧法类似，需要DNA聚合酶合成互补链 * 还有另外3种酶与DNA聚合酶组成级联化学发光反应 * 每一轮测序反应中，只加入一种dNTP * 若该dNTP与模板配对，聚合酶将其参入到引物的3'端，释放等量的焦磷酸基团（PPi） * PPi可转化为可见光信号 * 步骤 * 将待测的单链DNA作为模板，与其特异性的测序引物结合 * 加入4种酶的混合物 * 向反应体系中加入1种dNTP * 若能与模板结合并释放出PPi * PPi被催化产生可见光，通过电耦合器光学系统，获得一个特异的检测峰 * 峰值的高低和相匹配的碱基数呈正比 * 反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP被催化降解 * 加入另一种dNTP，按上述步骤重复进行 * 应用 * DNA测序 * 通过比较亚硫酸盐处理前后的测序结果，快速地检测目标DNA甲基化的频率和样式，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测 * 亚硫酸盐能将未甲基化的C变成U * PCR后拷贝链发生变化
Illumina/Solexa测序
* 类似Sanger法，进行DNA合成，并使用链末端核苷酸终止剂 * 使用的末端终止剂不是双脱氧核苷酸，而是单脱氧核苷酸，且参入是可逆的 * 4种作为末端终止剂的单脱氧核苷酸在3'-OH带有不同荧光标记
SOLiD/Applied Biosystem测序
第三代DNA测序
核心特征
对单分子DNA测序
* 反应在纳米容器内进行 * 使单个核苷酸发出的单道闪光能够检测到 * 荧光标签不一定标在参入的脱氧核苷酸上 * 可能在释放出来的焦磷酸基团上
两种途径
基于显微技术
基于纳米技术
第四代DNA测序
不再使用光检测，而是使用离子流测序
* 测定的是伴随一个新脱氧核苷酸参入释放出来的质子
不适用于单分子测序
速度极快
单细胞基因组DNA测序
分离出单个细胞
进行全基因组扩增
* 多重取代扩增
构建测序文库
使用新一代测序技术进行序列分析
RNA一级结构的测定
直接测定
质谱分析
间接测定
用反转录酶构建cDNA
直接测定cDNA序列
反推出互补的RNA序列
