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兽医病理诊断学技术知识点总结
概念：将熔化的石蜡倒入金属包埋框，再将浸好蜡的组织块平放底部，注意切面方向朝下放置，待石蜡凝固后去掉包埋框。
编辑于2022-05-03 19:32:44- 病理诊断学
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兽医病理诊断学技术知识点总结
第一章：概述
兽医病理诊断技术的
性质、任务及内容
兽医病理诊断技术的性质
兽医病理诊断技术是兽医病理学的一个组成部分，它运用兽医病理学理论和病理学研究方法及手段，
对疾病进行诊断，是畜禽疾病诊断的重要方法之一。
兽医病理诊断技术的任务
研究疾病的病变特点
病理学诊断和鉴别诊断
兽医病理诊断技术的基本内容
病理诊断实验室的基本设备和要求
病料的采取和寄送
动物死后的变化及其鉴别
各种动物的尸体剖检技术
病理剖检记录的编写和内容
病理组织学诊断技术
病理机能学诊断技术
兽医病理诊断技术的发展
器官病理学
尸体解剖检查
组织病理学
显微镜、组织切片和染色
超微病理学
电子显微镜和超薄切片
分子病理学及免疫病理学
DNA和免疫技术
全自动生化分析系统
病理诊断实验室基本构成
诊断室
显微镜、暗室、病原鉴定室
剖检室
更衣室、尸体处理间
切片室
冷冻切片室、组织化学室
标本存放室
切片存放室、蜡块室、大体标本室
病理诊断技术的分类及其原理
动物实验
概念：在人为控制条件下， 在适宜动物身上复制某些疾病的模型，研究疾病的病因学、发病学、
病理变化及疾病的转归。
优点：可以控制实验条件、任意施加影响因素，可以随时和任意取材活检和处死尸检。
缺点：种属差异。
尸体剖检技术
运用病理解剖学及有关学科知识，通过检查动物尸体的病理变化，来诊断疾病
的一种方法。
特点：迅速、客观、准确
肾出血点
脾出血坏死
动物死后变化
概念：动物死亡后，受体内存在的酸和细菌的作用，以及外界环境的影响，逐渐发生
一系列的变化。
影响因素
外界环境因素
自然气候，尸体所处的环境
尸体内在因素
年龄、体型及疾病、死亡原因
人为因素
冷藏或冷冻。停尸载体及尸体体位
死后变化
尸冷
概念：早期尸体现象之一。动物死亡后，由于动物体内新陈代谢的停止， 产热过程休止，而体表散热继续进行，尸体温度逐渐降至外界环境温度 的水平，称为尸冷。
影响因素：环境温度、动物年龄、胖瘦、死因、有无疾病等。 在20 C左右尸温每h下降1 摄氏度；死亡12 h体表温度和环境温度相等
尸僵
概念：动物死亡后，肢体的肌肉收缩变硬，关节固定，整个尸体发生僵硬。
一般在死后3~6h发生，10～20h最明显，24～48h开始缓解。 根据尸僵发生和缓解情况可以判断家畜死亡时间。
影响因素
* 外界环境：温度高则尸僵出现早，消失也早;
水分多，湿度大，尸佃发生缓慢。
* 个体差异：肌肉发达的动物尸僵明显;
体弱动物尸僵出现较早而程度弱。
* 死因：肌肉有痉挛如破伤风、急性热性病者尸僵早而强;
磷中毒、败血症、全身衰弱者，尸僵迟而弱。
尸斑
尸体血液因重力而坠积于低下部位未受压迫的血管, 并在该处皮肤呈现有色班痕称为尸班。
注意尸斑和皮肤表面的其他病变的区别
尸体自溶和腐败
尸体自溶
* 概念：动物死后组织细胞失去生活能力，在其本身所释放的酶的作用下发生分解，而使各器官组织变软或液化，这种现象就是自溶。尸体的自溶过程同细菌无关，是自发进行的。 * 影响因素：环境温度、死因 * 自溶与组织坏死的区别 * 分布特点：将检查部分固定，则固定部分的自溶是
从中间开始而未固定而又离体的自融从边缘开始。 生前形成的坏死则没有分布规律。
* 速度和程度：各器官、内脏、组织、细胞的自溶速
度和程度是有一定的顺序的，而坏死则无顺序性。
* 形状：自溶常是弥漫性而坏死往往是局部性的。 * 病理变化：组织坏死的，在坏死灶周围一般都有炎
症反应，而自溶灶周围则没有。
尸体腐败
* 概念：指尸体组织蛋白由于细菌作用而发生腐败分解的现象。 * 参与腐败过程的细菌：主要是厌氧菌，主要来自消化道，也有从体外进入的。 * 尸体腐败表现：腹围膨大、尸绿、尸臭、内脏器官腐败等。
胆汁浸润
概念：主要出现在胆囊附近的浆膜，呈淡黄色或淡绿色，为胆汁外渗的结果。
临床症状
死后凝血
概念：死亡快时，血凝块呈-致的暗紫红色。死亡较慢时，血凝块往往分为两层，上层呈黄 色鸡油样的血浆层，下层是暗红色红细胞层(鸡脂样凝血块)。
死于败血症或窒息、缺氧的动物， 血液凝固不良或不凝固。
血凝块与血栓的区别
* 血凝块为血管破裂凝血，血栓为血管内凝血
血红蛋白浸润
概念：红细胞发生崩解，血红蛋白溶解在血浆内，并透过血管壁向周围组织浸润，心内膜和血管内膜以及周围组织被血红蛋白染成弥漫性红色，这种现象称为血红蛋白浸润。
器官/组织或细胞培养技术
从动物体内采取活的器官、组织或单细胞，用适宜的培养基(液)和创造相似于体内的其他条件，在体外进行培养并进行各种研究的技术方法。
活体组织和细胞学检查
简称活检，即用局部切取、细针吸取、钳取、搔刮和手术摘取等方法，从患病动物活体获取病变组织或细胞进行病理检查等。
优点：材料新鲜，保持活组织状态，可以在疾病的各个阶段取材。
缺点：取材有局限性。
应用：肿瘤病、皮肤病、口蹄疫或水疱病。
病理组织学诊断技术
通过观察组织和细胞的病理学变化，对疾病作出诊断。
常规的组织学诊断
组织切片、涂片——染色——光学显微镜观察——诊断疾病
石蜡组织切片：须3～5d时间
冰冻切片：只需30min左右。
组织/细胞化学技术
在组织切片上或被检材料上加显色剂，使它与组织或细胞中待检物质发生化学反应成为有色沉淀物以用光镜观察，若为重金属沉淀则用电镜观察,称电镜组织化学。可用于检测细胞内的酶类、糖类、脂类、核酸与金属元素等。
优点：原位反映出组织细胞化学成分的变化,形态观察与机能代谢相结合。
糖类显示法：过碘酸雪夫反应(PAS反应) :糖被强氧化剂过碘酸氧化后，形成2-醛基;后者与Schiff试剂中的无色品红亚硫酸复合物结合,形成紫红色反应产物。
酸性磷酸酶:切片放入含有酶底物(β -甘油磷酸钠)的溶液中孵育，底物经酶水解释放出磷酸，用捕捉剂确酸铅与磷酸反应，形成徽细的磷酸铅沉淀可在电糖下检出;再用硫化楼处理时，磷酸铅被换成硫化铝沉淀，可在光镜下见到。
核酸显示法: Feulgen反应， 切片先经稀盐酸处理后，使细胞内DNA水解，打开DNA分子中胶核糖核酸和冷碱之间的连接按健，使其秤放出醛基，再用Schiff试剂处理，形成紫红色反应产物。
免疫组织化学/免疫细胞化学
原理：用标记的抗体对细胞或组织内的相应抗原的分布进行细胞和组织原位的定性、定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。
根据标记物的不同，可分为免疫荧光、免疫酶标、胶体金标记技术。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和兔疫酶法。
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核酸原位杂交与原位PCR技术
核酸原位杂交是用已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交对其实行检测的方法，是将组织化学与分子生物学技术相结合来检测和定位核酸的技术。
原位PCR则是将组织切片或细胞涂片中的核酸片段进行原位扩增，在扩增中掺入示踪剂或扩增后进行原位杂交，观察基因表达。
生物芯片技术
基因芯片：将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度地排列在如硅片等载体上，被检测的DNA或cDNA用放射性核素或荧光物标记后与固相阵列杂交，然后通过放射自显影或激光共聚焦显微检测杂交信号的强弱和分布，再通过计算机软件处理分析，得到有关基因的表达谱。
应用：疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物优育优选、司法鉴定、食品卫生、环境检测、国防、航天等领域。
超微结构观察或电镜观察技术
运用透射和扫描电子显微镜技术，对组织细胞的内部及表面的超微结构进行观测，从亚细胞(细胞器)甚至是大分子水平上了解组织细胞的形态和机能变化，使之对某些疾病的诊断和鉴别诊断更加确切,加深对疾病本质的认识。
######
图像分析技术
图像分析软件可为图像采集、定量测量和图像分析报告；在计算机进行图像可视化以及数据化处理。
CCD是一种半导体器件，能够把光学影像转化为数字信号;能够使显微镜上观察到的图像输出到计算机。
远程病理学
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流式细胞术技术
将特殊处理的细胞悬液经过一细管，同时用特殊光线照射，光线发生不同角度
的散射，经检测器变为电讯号，再经计算机贮存分析后画出直方图等。
病理机能学诊断技术
指采取病畜的血液、尿液、粪便或.其他体液及病理产物(如胃液、脑脊髓液、胸腹腔穿刺液等) ,测定其物理性状，分析其化学成分,或借助于显微镜观察其有形成分。
兽医病理诊断的基本程序
收集病历资料
通过问诊了解患病动物的临床表现，要做到心中有数，有的放矢。主要了解临
床症状，发病动物的年龄，发病率，死亡率等，动物死亡前的饲养管理情况，用药情况等。根据搜集的病历资料，初步推断动物死亡的可能原因，依据动物防疫和检疫的相关条例，决定能否进行动物尸体剖检。例如，当怀疑为炭疽时，禁止剖检。
检查与初诊
可以进行尸体剖检的动物尸体,方能按照兽医病理诊断基本程序进行检查，包括尸体剖检，观察死亡动物生前的各种组织器官的眼观病理变化。发现病理变化后，采集病理标本，进行常规组织病理学检查，必要时可进行超微病理学检查帮助观察诊断。在需要时，可运用其他技术等进行诊断。
综合诊断与结论
根据临床病历资料，结合尸体剖检、组织病理学检查等实验结果，对上述全部的观察资料进行综合分析、综合判断,从而作出病理学诊断结果。结合病原学鉴定的结果，对疾病作出确切的诊断。
防治措施建议
根据综合诊断结果，提出有效的防治措施。
第三章：兽医病理组织学诊断技术
组织的脱水、透明和浸蜡
脱水
概念：借助某些溶媒置换组织内水分的过程。
注意事项
脱水剂必须能与水以任意比例混合
根据固定剂选择合适的脱水剂
常用的脱水剂
酒精
脱水程序：70%--.....--100%，柔嫩组织须从50%或30%开始
特殊标本如糖原或尿酸盐结晶染色的标本为防止在水中溶解消失，应直接用无水乙醇固定，经一次无水乙醇脱水即可
无水乙醇脱水时间不易过长，一面过度硬化切片困难
各级酒精2～4小时,视材料的大小、厚薄而定
脑组织、脂肪组织或疏松结缔组织,脱水时间要适当延长, 95%酒精中充分脱水,溶解脂肪,否则染色时易脱片
丙酮
脱水作用比乙醇强,但对组织块的收缩较大,主要用于快速脱水或固定兼脱水。脱水时间1～3小时左右
DNA和RNA染色后,可用丙酮脱水
异丙醇
无水酒精的良好替代品，组织收缩小，硬化作用较弱
环己酮
可与二甲苯、石蜡混合，可以替代无水乙醇脱水后直接浸蜡，组织不变硬
透明（媒浸）
目的：脱水后，须通过一种既能与酒精混合又能溶解石蜡的溶剂的作用，以达到石蜡浸入组织块的目的
作用
脱酒精
透明
概念：当组织中全部为透明剂占有时，其折射系数接近于组织蛋白的折射系数，组织块变得透亮，此过程称为透明
常用透明剂
二甲苯
优点：透明能力强，易使组织收缩、变脆
缺点：组织块在二甲苯中不宜久留，可用无水乙醇－二甲苯处理后再浸入二甲苯。对小动物组织材料必须严格控制好，通常为半小时到1小时左右
冬青油（水杨酸甲酯）
可用于骨组织石蜡切片的透明剂，常用冬青油和苯甲酸甲酯（5：3 ）的混合液进行透明
透明速度较慢，数小时或数天。一般经无水乙醇脱水后再入冬青油
苯甲酸甲酯
多应用于火棉胶切片。经95%酒精脱水的组织块可以直接用苯甲酸甲酯透明
香柏油
优点
* 能溶于酒精，是酒精脱水后的良好透明剂，对组织的收缩和硬化程度小，对组织损害小 * 对致密纤维及硬组织的透明效果好
缺点：透明时间长（24h）一般不用于组织块透明，常用于染色后透明
火棉胶包埋的媒浸液
乙醚乙醚和无水酒精等量混合配成和无水酒精等量混合配成
组织彻底脱水后，直接浸入12－24h。如组织块大，适当延长
浸蜡（浸透）
概念
组织经脱水透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡
用其他浸透剂（火棉胶、炭蜡和明胶等）浸入组织内部的过程称为浸透
注意事项
为了使石蜡充分渗入，减少组织收缩，一般先经低熔点石蜡再经高熔点石蜡
浸蜡的时间根据不同组织类型及其大小而定，一般3～4h。（时间长组织脆硬，易碎）
硬脂酸-蜡可以作为酒精和石蜡的中介剂，组织硬度适宜，且可以省去二甲苯
不同厚度组织块的脱水、透明和浸蜡的时间
组织的包埋和包埋方法
概念：组织块经过浸透剂浸透，用包埋剂包起的过程称包埋
石蜡包埋法
常规石蜡包埋法
概念：将熔化的石蜡倒入金属包埋框，再将浸好蜡的组织块平放底部，注意切面方向朝下放置，待石蜡凝固后去掉包埋框
注意事项
注意有无特殊的包埋面，且包埋面必须平整
包埋温度不易过高（一般56℃）
选择合适的石蜡（柔软组织易用硬度底的石蜡）
快速石蜡包埋法
步骤
①取材，固定和脱水：小块薄组织（1x0.5x0.3）加入固定－脱水混合液（40％甲醛10ml＋95％酒精85ml和冰醋酸5ml），加热煮沸1－2min；修块至1.5mm以内，在丙酮中煮沸3－4次，每次换液
②透明：苯2min
③浸蜡：石蜡2min
④包埋：组织块在石蜡中下沉是即可包埋
火棉胶包埋法
用途：火棉胶常用于大组织块的包埋
优点：可避免纤维组织和肌肉组织的过度硬化，减少收缩，维持原有结构
程序
① 组织经固定、水洗后如50％和60％酒精各6－12h
② 70％，80％和90％酒精各6－12h
③ 95％和100％酒精各12－24h
④ 乙醚和无水酒精等量混合液24h
⑤ 2％火棉胶液（2g火棉胶、50ml乙醚、50ml无水酒精）24－48h； 4％火棉胶液24h－数周；8％火棉胶液24h－数周； 16％火棉胶液1周； 16％火棉胶液倒入平皿，组织平放，留缝隙使其蒸发指压无指纹即可
⑥ 倒入两倍量氯仿，硬化12－24h
⑦ 修去多余火棉胶，入80%酒精硬化6h
⑧ 将胶底面和木块同时浸入乙醚酒精混合液，稍溶后粘合，乙醚酒精挥发后入80％酒精硬化，即可切片
其他包埋方法
树脂包埋法：用于不脱钙骨髓活检组织，肝、肾活检组织
明胶包埋法：冰冻切片
双重包埋法：适用于既有骨皮质又有软组织的标本
炭蜡包埋法等等
组织切片法
石蜡切片法
冰冻切片法
直接冰冻切片法
用途：用于新鲜组织，甲醛固定组织和低温冷冻组织
方法
恒冷箱切片：须OTC包埋
半导体制冷法：利用温差电偶和水循环将电偶发热一端的热量带走从而达到制冷目的的制冷方法，其制冷的效果与机器所设计的电流大小有关，半导体制冷的温度可以由电流强度进行控制
二氧化碳冰冻法：组织经经蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加少许蒸馏水，然后以二氧化碳气体将其冻结的制作方法
甲醇制冷器
明胶冰冻切片法
① 一般应用于易碎组织，特别是有树脂状突起的组织
② 甲醛固定组织应彻底水洗，避免影响明胶的凝固
③ 水洗组织浸入12.5％的明胶水溶液，37温箱浸6－24h，再入25％的明胶水溶液6－24h，25％明胶包埋，冰箱冷却固化
④ 10％甲醛固定明胶块24－48h，水洗后冰冻切片机或滑动切片机切片
⑤ 染色后可以不经脱水和二甲苯透明，以明胶液封片
冰冻切片的粘片法
分类
蛋白甘油粘片法：同石蜡切片
Lillie明胶粘片法：切片放入1％明胶水溶液中数分钟，捞起后以5％甲醛固定5min，水洗10min后染色
酒精明胶粘片法：切片浸入1％明胶溶液（40％酒精配制）数分钟，捞起，干燥，入氯仿1min，经95％和75％酒精去氯仿，蒸馏水洗即可
火棉胶切片法
切片方法
滑动式切片机
刀片与滑行轨道20o－40o组织硬则角度小。清除角4o－6o。右手推刀，左手用毛笔蘸80％酒精，随时湿润胶块和切片刀
注意事项
* 湿切，组织块一直保存在70％酒精中，防止火棉胶挥发，硬度 * 切片时随时用70％或80％酒精湿润组织块和刀片，保持适度和硬度 * 乙醚溶解组织块底部，然后以8％火棉胶粘组织块
蛋白甘油粘片法
明胶粘片法
火棉胶粘片法
捞片后，吸干酒精，在切片上薄涂一层0.5％的火棉胶溶液，蒸馏水洗后染色
染色
石蜡切片的苏木素-伊红染色
HE染色的基本原理
细胞核染色原理
DNA双链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，易于和带正电荷的苏木素碱性燃料以离子键或氢键结合，而被染色
细胞浆染色的原理
伊红是酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷结合而使细胞浆染色
二甲苯、酒精和水洗的原理
二甲苯：脱蜡，透明
酒精：脱水和入水
水洗：入水，洗脱多余染料，终止分化
分化和返篮的作用
分化
* 概念：细胞核中结合过多的染料和细胞浆中结合吸附的染料必须用1％盐酸脱去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明 * 酸能使色素和组织解离，分化不能过度
返蓝
* 概念：苏木素在酸性环境中处于红色离子状态，在碱性条件下处于蓝色离子状态。以弱碱水或自来水浸洗即可返蓝
染色前切片预处理
步骤
* 1. 脱福尔马林色素 * 2. 脱汞盐结晶：Lugol碘液20min,水洗5min，95％酒精10min，水洗后5％亚硫酸钠5min * 3. 脱黑色素：0.25％高锰酸钾1－3h，水洗1min，草酸30min
染色的注意事项
组织切片脱蜡
与二甲苯的温度及时间有关，二甲苯使用时间过长，应及时更换
分化适当
分化不当致使应该分化脱色的部分末予脱去，或分化不足致染色不均匀，复染对也不能得到对比鲜明的色彩
脱水彻底
伊红染色后必须经梯度酒精脱水，特别需要经过无水乙醇，脱水一定要彻底，否则，影响透明
透明充足
透明应注意时间充足，封片时，中性树胶适量
染色良好的例子
######
石蜡切片免疫组织化学染色
实验步骤
1.烤片：将组织切片置于切片架上，65℃烘箱烤片 20min
2.脱蜡至水： 二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ 20min→100%酒精Ⅰ2min→100%酒精Ⅱ
2min→95% 酒精 2min→90%酒精 2min→80%酒精 2min→流水冲洗 3min
3.酸性微波修复：将组织切片放入枸橼酸盐修复液（pH6.0）中，进行微波修复，高火维持 5min，
停火 2min，低火维持 20min，结束后取出，自然冷却至室温，PBS 洗 3 次，5min/次 碱性高压修复：将组织切片放入碱性修复液中，高压修复 2.5min，结束后取出，自然冷却至室温， PBS 洗 3 次，5min/次
4.去除内源性过氧化物酶活性：取出切片，使用吸水纸擦去组织周围水分，用免疫组化
笔在组织周围距离组织 2mm 左右画圈，在圈内滴加过氧化物酶阻断剂，室温作用 15min （注意避光），PBS 洗 3 次，5min/次
5.封闭：弃去组织上的 PBS，滴加山羊血清，切片放入湿盒内室温孵育 30min
6.孵育一抗：弃去组织上的山羊血清，滴加一抗工作液覆满组织，切片放入湿盒，于 4℃
冰箱过夜，或放入 37℃温箱孵育 2h
7.孵育二抗：取出湿盒，弃去组织上的一抗，PBS 洗 3 次，5min/次；滴加二抗覆满组
织，于湿盒内室温孵育 30min
8.显色：弃去组织上的二抗，PBS 洗 3 次，5min/次；在圈内滴加 DAB 显色液覆满组织，
显色时需避光，于显微镜下观察显色效果
9.终止显色：当组织出现明显阳性信号，于水中终止显色，流水冲洗 5min
10.复染：苏木素复染 7min，流水冲洗约 3min 至水变清亮，0.5%盐酸分化 13s，流水
冲洗 8min
11.脱水透明：80%酒精 2min→90%酒精 2min→95%酒精Ⅰ 2min→95%酒精Ⅱ 2min→100%
酒Ⅰ2min→100%酒精Ⅱ 2min→100%酒精 Ⅲ 2min→二甲苯Ⅰ 5min→二甲苯Ⅱ 8min
12.封片：中性树胶封片，自然晾干
特殊染色方法
结缔组织染色法
胶原纤维染色
Masson 三色染色法
* 染色原理 * Masson是通过改良Mallory三色法建立的结缔组织多色染色方法，该法以红蓝黑3种颜色显示结缔组织多种成分，尤其是对于胶原纤维和肌纤维的鉴别作用非常明确 * 染色液 * * 染色步骤 * 1. 切片脱蜡至蒸馏水 * 2. 苏木素染5～10min * 3. 盐酸酒精分化 * 4. 流水蓝化，蒸馏水洗(苏木素可不染) * 5. 丽春红酸性品红液中染5～8min * 6. 蒸馏水洗 * 7. 1% 磷钼酸中染1～3min * 8. 直接入苯胺蓝液或亮绿液5min * 9. 水速洗，置60℃温箱中烘干，二甲苯透明，封固 * 染色结果 * 胶原纤维蓝色（苯胺蓝复染）或绿色（亮绿复染）,肌纤维、纤维素红色
Van Gieson染色法
* 试剂配制 * 1. Weigert铁苏木素液 * A液：苏木素 1g：无水酒精 100ml * B液：30％三氯化铁；蒸馏水 100ml；纯盐酸 1ml * 注意事项：临用前A、B液等量混合 * 2. Van Gieson 染液 * A液：1％酸性品红水溶液 * B液：苦味酸饱和水溶液（1.22％） * 注意事项：临用前A、B液1:9混合 * 3. 1%盐酸酒精液 * 70％酒精 99ml；纯盐酸 1ml * 染色结果 * 胶原纤维呈红色 * 肌纤维、胞质及红细胞呈黄色 * 细胞核呈蓝褐色 *
应用
* 区分肿瘤组织的起源 * 观察炎症修复情况 * 观察肝硬化早期假小叶的形成 * 区分胶原纤维透明变性和淀粉样变
网状纤维染色
方法
* Foot染色法 * Gordon-Sweet染色法等
应用
* 显示与鉴别肿瘤的性质 * 研究肿瘤组织的发生、发展及恶性程度 * 用于某些肿瘤的诊断
糖原染色
染色方法
Best胭脂红染色法
过碘酸雪夫反应法
* 染色原理 * 高碘酸是一种氧化剂，它能破坏多糖结构的碳键。组织切片首先用高碘酸溶液氧化，使存在于组织多糖分子的乙二醇基或氨羟基的碳键打开，生成醛基化合物。暴露出来的游离醛基与无色品红溶液作用，生成新的红至紫红色复合物而得到定位 * 主要试剂 * 雪夫试剂; 高碘酸 ; Mayer 苏木素 * 染色步骤 * 1、切片脱蜡至水 * 2、滴加高碘酸溶液染色 10min * 3、 蒸馏水洗，小心擦干切片上多余水份 * 4、滴加雪夫试剂避光染色 30min，流水洗10min * 5、Mayer 苏木素浅染细胞核 1-2min * 6、酒精脱水，二甲苯透明中性树胶封片 * 染色结果 * 糖原、中性粘液物质呈红色，胞核呈蓝色
应用
区别HE染色中细胞内的糖原，脂肪变性和水泡样变，三者都是空泡
研究糖原积累病
肿瘤的诊断和鉴别诊断（肝细胞癌阳性，胆管癌阴性）
神经组织染色
尼氏体染色
甲苯胺蓝染色法，缓冲亚甲蓝法等
应用：炎症、变性时尼氏体减少或消失
神经元及神经纤维染色法
甘氨酸银镀法，Holmes染色法，Golgi法等
应用：观察神经病变
脂肪染色
改良的油红O染色法，苏丹III染色法等
应用
鉴别实质脏器的脂肪变性
肿瘤组织的鉴别诊断
病原微生物染色
细菌染色
改良的革兰氏染色法
* 染色液 * 苯胺品红液：碱性品红0.6g和石炭酸1g分别溶于100ml 30％酒精中，然后加入1ml苯胺，过滤 * 结晶紫溶液：将结晶紫0.5g溶于90ml蒸馏水中，加入2ml苯胺和10ml无水乙醇 * 革兰氏碘液：碘0.5g，碘化钾1g，溶于150ml蒸馏水中 * 染色方法 * ① 切片脱蜡至水 * ② 苯胺品红液染10－30min * ③ 自来水1min * ④ 浸入甲醛，至切片呈玫瑰红色为止 * ⑤ 自来水1－2min，蒸馏水5－10min * ⑥ 结晶紫3－5min * ⑦ 自来水1－2min，蒸馏水5－10min * ⑧ 革兰氏碘液1min，吸水纸吸干 * ⑨ 苯胺、二甲苯等量混合液洗切片至不褪色 * ⑩ 二甲苯透明，中性树胶封固 * 染色结果 * 革兰氏阳性菌——蓝紫色；革兰氏阴性菌——红色
真菌染色法
六铵银染色
* 染色原理：利用铬酸和高碘酸氧化真菌内细胞壁内的粘多糖等成分而暴露出醛基，醛基还原六胺银内的银离子为黑色的金属银而显色。氯化金用来调色，可排除组织中的黄色色调。硫代硫酸钠对已显色的银盐起固定作用，并除去未反应的银离子 * 染色步骤 * 1. 常规脱蜡至水:二甲苯 I,20min——二甲苯 II，20min——无水乙醇 I，2min——无水乙醇
II，2min——95%乙醇 III，2min——90%乙醇，2min——80%乙醇，2min——蒸馏水洗， 5min
* 2. 5% 铬酸氧化 30 min，蒸馏水洗 3 次，每次 5min * 3. 六胺银硼砂染色液 30-90min（30min 开始观察染色情况）,当切片呈棕褐色,镜下能够看到
明显的黑色菌丝时终止
* 4. 氯化金调色 3sec，蒸馏水洗 2 次，每次 3min * 5. 硫代硫酸钠 3sec，蒸馏水洗 2 次，每次 3min * 6. 淡绿复染 3sec * 7. 脱水，透明：乙醇每道 3min, 二甲苯每道 5min，中性树胶封片 * 染色结果：曲霉菌的孢子和菌丝均被染为深黑色，菌丝呈多结节分布，呈45度角分枝，有的如散花状分布，其它菌丝显示黑色 * 染液配制 * 1. 六胺银储备液 * （A 液）3％六次甲基四胺水溶液 * （B 液）5％硝酸银水溶液体积比为 20∶1。两液混合呈
乳白色，瞬间透明，澄清液在 4℃冰箱保存：，可用数月
* 2. 六氨银硼砂染色液 * 六胺银储备液：蒸馏水：（C 液）5％硼砂溶液体积比 25mL∶25mL∶2mL
病毒染色法
包涵体
* 概念：病毒感染细胞后在胞浆内形成的一种光学显微镜下可见的特殊结构，富含病毒的区域 * 大多数包涵体由病毒子组成，少数包涵体是细胞对病毒反应的产物。如狂犬病的 Negri 氏体
染色法
* Mann亚甲蓝伊红染色法 * 材料 * 亚甲蓝伊红染液：1％亚甲蓝水溶液6ml， 1％伊红水溶液6ml，蒸馏水28m * 分化液：无水酒精100ml，40％氢氧化钠3滴 * 操作方法 * ① 切片脱蜡至水 * ② 亚甲蓝伊红染液8－24h * ③ 蒸馏水10－20sec * ④ 分化液20－30sec * ⑤ 丙酮脱水，二甲苯透明，中性树胶封固 * 染色结果 * 包涵体、尼氏体呈红色，细胞核呈蓝色 * Stovall-Black包涵体染色法 * Lendrum包涵体染色法 * Giemsa包涵体染色法 * 操作方法 * 1. 切片脱蜡至水，蒸馏水洗 * 2. 浸入0.01M磷酸盐溶液(PBS)PH7.6中,换洗3次,3分钟/次 * 3. 浸染于PH7.6的Giemsa染液中过夜 * 4. PBS冲洗15分钟 * 5. 0.01%柠檬酸水溶液分化，于镜下控制 * 6. 蒸馏水洗 * 7. 吸水纸吸干或风干切片 * 8. 丙酮脱水，1-2分钟 * 9. 入1：1丙酮和二甲苯1-2分钟 * 10. 二甲苯透明，中性树胶封固 * 染色结果 * SARS病毒包涵体于肺细胞胞浆中呈现鲜红色；合胞病毒，巨细胞病毒包涵体于肺组织的细胞核内，在没有形成包涵体前呈鲜红色，形成包涵体后呈深紫色至蓝色。红血细胞显示绿色
肥大细胞甲苯胺蓝染色
实验原理
肥大细胞颗粒中含有肝素等成分，这些可导致机体的过敏反应，肝素既是高分子的多硫酸脂，也是硫酸粘多糖类，它含有酸根，故能被异染性染料甲苯胺蓝所显示
染色步骤
1.组织切片常规脱蜡至水
2.甲苯胺蓝液滴染30min
3.稍水洗
4.入冰醋酸液分化，直到胞核和颗粒清晰
5.稍水洗，用冷风吹干
6.二甲苯透明，中性树胶封固
染色结果
肥大细胞颗粒呈红紫色，胞核蓝色
试剂配制
1.甲苯胺蓝液：甲苯胺蓝0.5g，蒸馏水加至100ml。
2.冰醋酸液：冰醋酸0.5ml，蒸馏水99.5ml
第二章：病理诊断实验室建设要求
基本构成和房屋建筑要求
基本构成
诊断室
剖检室
切片室
* 标本存放室
显微镜室
更衣室
冷冻切片室
* 切片存放室
暗室
尸体处理间
组织化学室
* 蜡块室
病原鉴定室
大体标本室
房间建筑要求
剖检室
面积适当，光照充足，通风良好，地面、墙裙应易于清洗消毒，水源充足，有专用下水道
切片室
地面、墙裙的建筑材料具有很好的防火性能，配置空调设备
标本存放室
通风良好，有空调设备
诊断室
防尘、防潮、防腐蚀、空调设备
基本设备及器械
剖检室的基本设备及器械
解剖台：光滑易于清洗消毒，具有防腐性能
紫外线消毒灯，照相设备、冰箱和冰柜等设备
标本巨检器械
尸体剖检器械
标本存放容器及常用固定液
常用消毒药品
防护材料
病理切片室的基本设备及器械
仪器
切片机，各式切片刀，磨刀机，水浴锅、漂烘仪、恒温箱、光学显微镜、显微照相设备、
低温冷冻设备、微波炉、冰箱、天平、干燥器等
配制试剂用具
染色缸，载玻片，盖玻片
常用试剂及染料
不同熔点的石蜡，酒精，二甲苯，树胶，蛋白甘油，明胶或多聚赖氨酸，染色的染料：苏木素，伊红，结晶紫，姬姆萨染料、美蓝、刚果红、油红O，苏丹Ⅲ等，盐酸、氨水、浓硫酸、重铬酸钾等
免疫组织化学常用设备
微波炉
用于抗原修复和固定
微量加样器
各种不同规格的加样器，用于试剂的稀释和滴加
微型震动器
用于滴加试剂后团片的震动，以加速分子的运动
恒温水浴箱或湿盒
用于滴加试剂后的孵育，防止干燥，保证染色效果
标本存放室的基本配置
标本存放室应根据标本数量大小制作相应的存放大体标本、组织蜡块和组织切片盒的标本柜，标本柜应有明确清晰的标签，并有详细的登记，以便于观察与回顾性研究
生物安全要求
病理诊断实验室潜在生物危害
对人员的潜在危害
人畜共患病的传染；实验动物的咬伤、抓伤、踢伤等
过敏原：动物尿液、唾液、毛发、皮屑
对环境的潜在危害
废气：气溶胶、臭氧
废水：洗刷用水、手术用水、其它用水
废物：垫料、动物尸体或组织、一次性物品等
意外事故
人间传染的病原微生物名录
病毒分类名录
细菌、放线菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体分类名录
生物安全分级（ABSL）
一级动物实验生物安全水平（ABSL-1）
能够安全地进行没有发现肯定能引起健康成人发病的，对实验室工作人员、动物和环
境危害微小的、特性清楚的病原微生物感染动物工作的生物安全水平
二级动物实验生物安全水平（ABSL-2）
能够安全地进行对工作人员、动物和环境有轻微危害的病原微生物感染动物的生
物安全水平
这些病原微生物通过消化道和皮肤、粘膜暴露而产生危害
三级动物实验生物安全水平（ABSL-3）
概念：能够安全地从事国内和国外的，可能通过呼吸道感染、引起严重或致死性疾病的病原微生物感染动物工作的生物安全水平
与上述相近的或有抗原关系的但尚未完全认识的病原体感染，也应在此种水平条件下进行操作，直到取得足够的数据后，才能决定是继续在此种安全水平下工作还是在低一级安全水平下工作
四级动物实验生物安全水平（ABSL-4）
能够安全地从事国内和国外的，能通过气溶胶传播，实验室感染高度危险、严重危害人和动
物生命和环境的，没有特效预防和治疗方法的微生物感染动物工作的生物安全水平
与上述相近的或有抗原关系的，但尚未完全认知的病原体动物试验也应在此种水平条件下进行操作，直到取得足够的数据后，才能决定是继续在此种安全水平下工作还是在低一级安全水平下工作
BSL-4实验室
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动物实验生物安全防护
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个人防护装备
眼睛与脸部护具；头部护具；手部护具；足部护具；全身护具
动物实验注意事项
坚持安全第一
保护自己、保护他人、保护环境
坚持慈悲为怀
善待动物、维持动物福利
坚持3R原则
优化refinement、减量reduction、替代replacement
病理解剖的生物安全防护
解剖室设计图