生物制药原理与技术

生物制药原理与技术课程梳理及重点：EGFR本身具有酪氨酸激酶活性，一旦与表皮生长因 子（EGF）结合可启动细胞核内的有关基因，从而 促进细胞分裂增殖。泰欣生竞争性结合EGFR，阻断 由EGFR介导的下游信号转导通路，从而抑制肿瘤细 胞增殖、诱导分化、促进细胞凋亡、抑制肿瘤血管 生成、增强放化疗疗效。

生物制药原理与技术

• 疫苗菌苗和治疗性抗体药物
  • 疫苗和菌苗
    • 疫苗和菌苗的种类
      • 常规疫苗
      • 亚单位疫苗
      • 基因工程疫苗
      • 合成肽疫苗
      • 遗传重组疫苗
      • 抗独特型抗体疫苗
        • 抗体1(Abl)的V区存在5~6个个体特异性的氨基酸结构,称为独特位，它们也可以作为抗原表位诱导抗体2(Ab2)的产生。独特位1 是Abl上与抗原表位结合的部位，它诱导产生的Ab2又称Ab2β，为抗原的 “内影像”,可模拟抗原并竞争性抑制Ab1与抗原的结合。以Ab2β做成的疫苗 就是抗独特型抗体疫苗。
    • 疫苗的制造方法
      • 毒种的选择和减毒
      • 病毒的繁殖
        • 动物培养
        • 鸡胚培养
        • 组织培养
        • 细胞培养
      • 疫苗的灭活
        • 试剂
          • 甲醛溶液(如乙型脑炎疫苗、脊髓灰质炎灭活疫苗等)
          • 酚溶液(狂犬疫苗)
        • 原则
          • 要以足够高的温度和足够长的时间破坏疫苗的毒力，而以尽可能的最低温度和最短时间来尽量减少疫苗免疫原性的损失。
      • 疫苗的纯化
        • 目的是去除存在的动物组织；在细胞培养的过程中，得用换液的方法除去培养基中的牛血清。
    • 菌苗类制品和类毒素的制造方法
      • 菌种的选择
      • 菌种的培养
        • 结核杆菌需以甘油作为碳源
      • 杀菌
        • 制备死菌苗用。 各种菌苗所用的杀菌方法不相同，但总目标是彻底杀死细菌而又不影响其免疫原性。 以伤寒菌苗为例，可用加热杀菌法、甲醛溶液杀菌、丙酮杀菌等方法。
      • 稀释、分装和冻干
        • 活菌苗，亦可于分装后冷冻干燥
  • 主要疫苗和菌苗的制造工艺
    • 治疗流感的药物神经氨酸酶抑制剂的作用原理
      • 流感病毒侵染宿主后其表面的HA血凝素与宿主上皮细胞表面的血凝素受体结 合，进入细胞， 其基因利用宿主细胞的资源进行复制和表达，最终重新组装成新的流感病毒颗粒，以出芽的形式突出宿主细胞， 但是成熟的流感病毒与宿主细胞之间，仍然依靠血凝素分子末端的唾液酸残基与血凝素受体分子表面的糖基团以2-6或2-3糖苷键链接，这使得流感病毒无法立即脱离宿主细胞。 NA神经氨酸酶负责催化水解这一重要的糖苷键（NA神经氨酸酶负责催化唾液酸与糖蛋白之间糖苷键的水解），使成熟的病毒颗粒最终脱离宿主细胞，感染新的上皮细胞，造成流感病毒在患者体内的扩散。 而神经氨酸酶抑制剂就可以与NA结合，阻止这一糖苷键的水解，抑制流感病毒在体内的扩散。
    • 重组乙型肝炎疫苗（酵母）
      • 第一代乙肝疫苗—血源乙肝疫苗, 第二代乙肝疫苗 —重组乙肝疫苗( CHO 细胞)
      • 大三阳：HBsAg,HBcAb,HBeAg 小三阳：HBsAg,HBcAb,HBeAb
        • 乙肝五项顺序HBsAg, HBsAb, HBcAb, HBeAg, HBeAb
      • 制备工艺
    • 卡介苗
      • 结核杆菌
      • 活疫苗（弱毒疫苗）；没有灭活
  • 治疗性抗体
    • 抗体药物概述
      • 动物来源血清抗体→鼠源性单克隆抗体→嵌合抗体；人源化抗体
      • 第一代抗体药物源于动物多价抗血清
      • 第二代抗体药物是利用杂交瘤( hybridoma)技术制备的单克隆抗体
      • 第三代抗体药物即基因工程抗体
    • 单克隆抗体
      • 传统单克隆抗体的制备
        • 多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。 单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）：由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高。
        • 一、动物免疫
          • 用于免疫的抗原大致可分为两类：可溶性抗原和颗粒抗原 可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂， 常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
          • 常用免疫途径：肌肉注射，皮下注射，腹腔注射
        • 二、细胞融合及HAT筛选
          • 细胞融合方法： 病毒介导的细胞融合 PEG（聚乙二醇）介导细胞融合 电激融合
          • 用HAT培养基筛选
            • 原理
              • 氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻碍起始合成途径。HAT培养基中含有氨基蝶呤时，细胞只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。杂交瘤细胞的起始合成途径被氨基喋呤阻断，但可通过中间合成途径利用以培养基中次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷为原料进行合成。而缺失中间合成途径的瘤细胞，失去增殖能力，从而选择出杂交瘤细胞
            • 饲养细胞
              • 在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞被称为饲养细胞。
              • 常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。 小鼠腹腔巨噬细胞是终末分化细胞，不会增殖，在条件适宜下可生活2－3周，有吞噬清除死亡细胞的作用。
        • 三、抗体的检测
          • 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)(常用)
            • 间接法：通用性强；节约成本
            • 夹心法：有针对性应用酶标；麻烦
          • 间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence, IFA)
          • 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA)
        • 四、克隆化
          • 常用克隆化方法
            • 有限稀释法是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔细胞培养板中，使每个孔中在理论上只含有一个细胞。 由于单个细胞难以存活，克隆化时也需加入饲养细胞辅助其生长。
            • 软琼脂法是在培养液中加入1.0%的琼脂，细胞分裂后形成小球样团块，可用毛细吸管将小球吸出，团块打 碎后，移入96孔板中继续培养
        • 五、大规模培养——批量生产单克隆抗体
          • 目前大量生产单克隆抗体的方法： 体内诱生(小鼠法)和体外培养（用生物反应器大量培养杂交瘤细胞)两种，体内诱生是利用生物体作为反应器，主要是在小鼠腹腔内，杂交瘤细胞生长并分泌单克隆抗体，是目前商业用单克隆抗体生产的主要方法。 体外培养法有悬浮培养、中空纤维法、包埋培养和微囊化培养几种。
      • 基因工程抗体技术
        • 鼠源性单克隆抗体临床治疗的局限性
          • 鼠源单抗可诱发人抗鼠抗体（HAMA）反应，鼠源性限制了它在人体内的应用， 生物半衰期很短， 抗体分子大，难以穿透毛细血管，降低了其靶向特异性。
        • 一、免疫学方面的改造
          • （鼠源性）单克隆抗体的人源化改造
            • 嵌合型单克隆抗体：对鼠源性单克隆抗体的恒定区进行人源化，即将鼠单克隆抗体的可变区与人的恒定区进行组合，最大限度保持抗体的亲和力和特异性。
            • 改形单克隆抗体：用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列。抗体分子中鼠源性部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。这种改形抗体又称CDR移植抗体。
              • 存在问题：抗体亲和力下降，甚至丧失活性。
                • 原因：人Ig框架区（FR）中的一些氨基酸与鼠Ig的CDR区不协调。 解决方法：亲和力重塑：将与鼠亲和力有关残基引入人Ig的框架区中。
            • 镶面抗体
              • 将鼠单抗可变区表面暴露的氨基酸残基改为人源的，就可以使可变区片段Fv表面人源化，消除了鼠源性并保留原抗体的特异性。
          • 单克隆抗体全人源化改造
            • 全部抗体分子都由人类基因编码
            • 噬菌体展示技术
              • 将外源基因插入丝状噬菌体基因组中，使表达的外源肽与噬菌体外壳蛋白一起展示在噬菌体表面，噬菌体展示技术初步形成。
              • 用噬菌体展示技术构建出抗体库，并从中筛选出人源化抗溶菌酶的单链抗体，使抗体制备技术进入全新的时代。
              • 原理
                • 将抗体蛋白基因克隆到噬菌体质粒上，抗体蛋白和噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面，被展示的蛋白可保持相对独立的生物学活性。
              • 载体构建要点
                • 载体构建、宿主菌的选择、纯化方法
                • —抗体基因—6个His基因—UAG—GeneⅢ—
                  • 琥珀密码子（amber codon）指mRNA的多核苷酸链中的终止密码子（UAG），它引起蛋白质翻译的中止。 6个His的串联序列，便于用二价金属离子进行金属螯合层析，纯化抗体蛋白。 在抗体基因与噬菌体外壳蛋白GeneⅢ之间设计了一个UAG终止密码子：当在琥珀突变抑制型菌株(supE)表达时，UAG被通读为Glu，表达产物为抗体-gP3融合蛋白，附着在噬菌体表面。用亲和层析纯化 当在琥珀突变非抑制型菌株中表达时，就会在UAG处翻译终止，产生可溶（或分泌）型的抗体蛋白。用二价金属离子进行金属螯合层析，纯化抗体蛋白。
            • 抗体库
              • 天然抗体库：抗体基因来源于未经免疫的个体
                • 免疫抗体库的抗体基因片段来自于经过抗原免疫的人体。
              • 免疫抗体库：抗体基因片段来自于经过抗原免疫的人体
                • 经过免疫选择，免疫抗体库中针对相应抗原的特异抗体丰度必然比天然抗体库高得多，更有利于筛选出针对特定免疫原的高亲和力、高特异性抗体。
          • 嵌合抗体 改型(CDR移植)抗体或表面重塑（或镶面）抗体 抗体库
        • 二、药理学方面（抗体分子大小的）改造
          • Fab片断
            • 由重链(VH-CH1)和完整轻链(VL-CL)通过二硫键形成的异二聚体，相对分子质量小，为完整抗体的1/3，
              • 有较强的穿透力，免疫原性低，能够与多种药物偶联作为导向药物的载体。 与其他小分子抗体相比，虽然体积较大，但是却能够最好地保留全抗体的亲和力，因而目前应用最为成功
          • 单链抗体scFv
            • 重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)通过一段刚性结构的15肽序列(Gly4Ser)3连接形成的重组蛋白。1/6
              • 1）只含有抗体的可变区，分子大小仅为完整IgG分子的1/6，但保持了完整的抗原结合位点； 2）缺乏Fc段，不与具有Fc受体的非靶细胞结合。 3）免疫原性低， 4）分子量小，容易穿透血管壁组织及实体瘤； 5）能直接与肿瘤细胞、病毒表面上的抗原结合。
          • 单域抗体sdAb
            • 单独的VH区也具有与抗原结合的能力，并且有完整抗体的特异性，将其称为单域抗体。1/12
              • 组织穿透力强，容易进入细胞，到达完整抗体不易接近的部位。
      • 单克隆抗体在治疗中的应用
        • 抗肿瘤
          • 利妥昔单抗（美罗华）
            • 一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。
            • 进入人体后可与CD20特异性结合， 通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）导致B细胞溶解， 从而抑制B细胞增殖，诱导成熟B细胞凋亡，但不影响原始B细胞。
          • 尼妥珠单抗（泰欣生）
            • 以表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）为靶点的单抗药物，中国第一个治疗恶性肿瘤的人源化单克隆抗体。
            • EGFR本身具有酪氨酸激酶活性，一旦与表皮生长因子（EGF）结合可启动细胞核内的有关基因，从而促进细胞分裂增殖。泰欣生竞争性结合EGFR，阻断由EGFR介导的下游信号转导通路，从而抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化、促进细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、增强放化疗疗效。
          • 贝伐单抗
            • 与人血管内皮生长因子(VEGF)结合并阻断其生物活性，VEGF可促进血管内皮细胞生长、增殖，并与血管内皮生长因子受体相结合，激活下游信号转导通路，最终促进新生血管的生成。
            • 子主题
              • 抑制肿瘤血管生成，饿死肿瘤疗法
          • 碘[131I]美妥昔单抗
            • 与肝癌细胞膜上广泛分布的抗原CD147特异结合，抗体偶联的碘131衰变产生的β射线杀灭肿瘤细胞。同时美妥昔单抗与抗原的特异结合，降低了肝癌细胞的转移与复发通道的信号传导，起到预防复发的目的。
        • 抗免疫排斥反应
          • OKT3单抗
            • 作用于T细胞表面的T3抗原识别结构，清除CD3+细胞，阻断T细胞识别抗原的功能，
        • 抗自身免疫性疾病
          • 阿达木单抗
            • 特异性与TNF-α（抗人肿瘤坏死因子）结合，并阻断其与细胞表面的TNF受体结合。
          • 贝利单抗
            • 抑制B-细胞活化因子
        • 抗病毒感染
          • 帕利珠单抗
            • 靶向呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白
        • 抗过敏反应
          • 奥马珠单抗
            • 靶向肥大细胞与嗜碱性粒细胞表面IgE受体
        • 单抗导向药物的临床应用
          • 免疫毒素
            • 生物导弹
              • 利用抗肿瘤单抗与肿瘤细胞的特异性结合，将生物毒蛋白与抗体偶联，去定向攻击肿瘤细胞，而其对正常组织的杀伤较小
            • 核糖体失活蛋白
            • 目前临床用于抗肿瘤制剂的毒素主要有：白喉毒素、相思豆毒素、蓖麻毒素等。
    • 治疗性抗体制造工艺举例
      • 赫赛汀Herceptin（抗肿瘤的治疗性抗体）
        • 靶向人表皮生长因子受体2(HER2)的人源化单克隆抗体。 HER2具有酪氨酸激酶活性。HER2与配体（表皮生长因子）结合后，自身磷酸化，其酪氨酸激酶活性被激活，最终促进细胞增殖，
      • 阿达木单抗（自身免疫性疾病的治疗性抗体）
        • 研发路线
          • ①构建人源性噬菌体抗体库
            • 抽取不同人的外周血，分离淋巴细胞，提取总RNA，设计特异性的引物，逆转录PCR扩增抗体κ轻链及γ重链的第一条cDNA，用含ApaL I和Not I限制性内切酶的引物扩增cDNA第二条互补链。 两个抗体基因组文库(κ轻链及γ重链)用 ApaL I和Not I消化，并插入到丝状噬菌体载体fd-tet中，构建成两个噬菌体抗体库，分别为γ亚型VHCH1重链库和VκCκ轻链库。
          • ②抗体库的筛选
            • 利用已获得的一株与TNF-α有高亲和力的鼠源性单抗MAK195， 将其重链克隆噬菌体载体，转染大肠杆菌表达。 将V κ C κ轻链库转染到已表达MAK195重链的大肠杆菌中，收集子代噬菌体，与TNF-α包被的载体结合，采用ELISA方法经过几轮筛选，获得与TNF-α有高亲和力的人源化轻链。 将此κ轻链基因扩增后转染大肠杆菌表达， 将人源化VHCH1抗体重链库转染到这些大肠杆菌中， 再同样的 ELISA方法筛选获得与TNF-α有高亲和力的人源化重链。将获得的高亲和力的人源化轻链和重链结合，即构成与TNF-α有高亲和力的人源化抗体的Fab片段， 通过基因工程手段与人源化Fc片段相连，得到全人源化的抗TNF-α的IgG抗体
• 重组治疗蛋白类药物和基因药物
  • 重组治疗蛋白类药物
    • 干扰素IFN
      • 对酸十分稳定，等电点＞4，用强阳离子交换层析进行纯化；对蛋白酶敏感；具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性
    • 白细胞介素与肿瘤坏死因子
      • 白细胞介素
        • 一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子
        • 白细胞介素-2( IL-2）
          • 正确的二硫键对活性是必须的， 因此重组的IL-2通常将125位游离的Cys残基突变为Ser或者Ala，这样就有利于重组蛋白产生正确的二硫键。
          • 应用
            • 对T细胞，NK和B细胞都有活化和激活作用
              • LAK（lymphokine activated killer cells）,淋巴因子激活的杀伤细胞 NK细胞或CTL体外培养时，在高剂量IL-2等细胞因子诱导下能够杀伤对它们不敏感肿瘤细胞
              • TIL(tumor infiltrating lymphocyte)肿瘤浸润的淋巴细胞， 包括T细胞和B细胞。
            • 过继性免疫治疗：通过体外培养、筛选并扩增肿瘤特异性T细胞进而回输患者体内，以达到放大机体抗肿瘤免疫目的肿瘤治疗方法。
              • 患者肿瘤组织内的 TILs的体外培养、扩增及肿瘤特异性的筛选
              • 利用基因工程技术修饰外周血T细胞。其中,CAR-T是利用基因工程修饰T细胞使其表达嵌合性抗原受体（chimeric angtigen receptor, CAR）来特异性识别肿瘤相关性抗原，是一种有前景的肿瘤免疫治疗策略。
      • 肿瘤坏死因子
        • 由单核细胞和巨噬细胞产生的一种非糖基化可溶性多能细胞因子。 大剂量应用TNF-α会产生严重的毒副作用 能够杀伤多种肿瘤细胞，引起肿瘤细胞坏死。
        • 制备
          • 疏水相互作用色谱（HIC） 溶液中高离子强度可以增强蛋白质与疏水性介质之间的疏水作用。 依据疏水相互作用大小不同而达到分离。
    • 血细胞生长因子
      • 红细胞生成素(EPO)
        • 糖基化是其生物学活性所必需的
        • 在人类胎儿和新生儿时期，肝脏是产生EPO的主要器官。成年期，EPO主要产生于肾脏，但肝脏仍保留产生EPO的能力。一些肿瘤细胞也能产生EPO。
        • 机体缺氧和贫血能诱导产生EPO
          • HIF：缺氧诱导因子，由两种不同的 DNA 结合蛋白质组成，即所谓的转录因子：HIF-1α 和 ARNT 当氧含量低（缺氧）的时候，HIF-1α 被保护住不会降解，并在细胞核里积累。它和 ARNT 相作用，并结合到特定 DNA 序列的缺氧调控基因（HRE）上 (1)。当氧含量正常时，HIF-1α 会被蛋白酶体迅速降解 (2)，氧气通过为 HIF-1α 增加羟基（OH）调控这一降解过程 (3)。然后，VHL 蛋白可以识别 HIF-1α，并形成一个复合体，根据氧含量浓度决定是否使它降解 (4)。
        • rhEPO的表达细胞系的建立
          • 将携带人EPO基因和携带二氢叶酸还原酶基因（dhfr）的质粒共同转染到dhfr缺陷的中国仓鼠卵巢细胞
          • 染料配体亲和层析所用的染料结构中都有三嗪环 ，可与羟基反应偶联到载体上，在它们之间形成醚键
      • 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)
        • 糖基能增加G-CSF的稳定性
        • 作为动员剂：G-CSF与干细胞因子（SCF）联合 从外周血采集造血干细胞简单、省事，故我国捐献造血干细胞较多采用此种方法；动员有效性的监测指标：CD34阳性细胞
    • 心血管疾病治疗药物
      • 组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)
        • t-PA是第二代溶栓药， 它的优点在于对血栓的特异性溶解作用。 游离的t-PA对纤溶酶原的亲和力很低， 而对纤维蛋白却有很强的亲和力，
      • 尿激酶原（ProUK）
        • 是一种碱性蛋白
        • 作用机理
          • ProUK是一种对纤维蛋白（血栓）有选择性的溶栓药物，其与血栓纤维蛋白 Y/E 片段亲和力强，出血风险较小，再通率高。 在无血栓存在时，ProUK 活力极低， 而在遇到血栓后，血栓纤维蛋白 Y/E 片段促进 ProUK 的酶活力，其将纤溶酶原转变成纤溶酶的活力增加 500 倍以上，但因栓塞血块中Y/E 片段含量是有限的，这一步的溶栓作用是很有限的， 被激活的纤溶酶又将血栓附近的ProUK 转化成尿激酶(UK)， UK进一步将血栓表面及周围游离的纤溶酶原转变成纤溶酶， 从而使血栓迅速溶解，当这些在血栓表面形成的纤溶酶或 UK 离开血栓后，即被血液中的蛋白水解酶抑制剂中和，因而不会导致系统性纤溶酶原活化及纤维蛋白的降解。；由于血管栓塞时， 栓塞前部血管表皮细胞因血压改变或缺氧，而大量释放贮存的t-PA， 导致栓塞血块部分降解， 使得其Y/E片段的含量明显高于非栓塞 (如伤口愈合时 )的血块， 因而使得尿激酶原能够倾向性诱导栓塞血块的溶解。
        • 与t-PA相较的优点
          • ① ProUK在血浆中不与蛋白水解酶抑制剂形成共价复合物, 使其在碰到血块之前, 不会消耗血液中的蛋白水解酶抑制剂而被中和掉。 这些抑制剂的存在与防止全身性出血直接相关。 而 t-PA则与抑制剂形成共价复合物, 既消耗自身, 又降低血液中抑制剂含量 。
          • ② ProUK具有栓塞血栓专一性。 t-PA的血纤维专一性使它对栓塞血栓与伤口愈合血栓具有同样的溶解能力,因此在治疗急性心肌梗死时可能造成更多的脑出血现象 。 ProUK则可在一定程度上避免这一不良反应的发生 。
      • 水蛭素
        • 活性多肽，是目前已知的最强有效的凝血酶抑制剂，是预防血栓形成的有效辅助药物。
        • 是一种凝血酶抑制剂，直接作用于凝血酶（thrombin），与凝血酶形成稳定的特异复合物，阻断凝血酶的蛋白水解功能。
    • 激素
      • 胰岛素
        • 是最早发现的一种具有激素作用的蛋白质 是胰岛β细胞合成和分泌，由A和B两条多肽链借助两个二硫键连接而成， 含有51个aa残基的蛋白质激素。
        • 生物学功能 胰岛素具有非常广泛的调节细胞代谢等的生物学功能，是维持人体正常代谢和生存所必需的激素。 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。
      • 生长激素GH
        • 人生长激素受生长素释放激素正调控， 受生长素释放抑制激素负调控
        • 睡眠时：睡眠时高于清醒时；前半夜分泌多；深度睡眠时分泌最多。
  • 基因药物
    • 基因治疗
      • 基因治疗的概念
        • 通过将特定遗传信息导入合适的靶细胞进行疾病治疗的一种方式。
      • 基因治疗的策略
        • 基因修正
          • 将特定的目的基因导入特定的细胞，通过定点的同源重组，让导入的正常基因精确地置换基因组内原有的缺陷基因。 难度大
        • 基因增补
          • 也称基因修饰(gene modification)， 仅将正常基因导入缺陷细胞或其他细胞，使目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能 或使原有的某些功能得以恢复或加强，而缺陷基因仍然存在于细胞内， 目前基因治疗大多采用这种方式
        • 基因沉默
          • 指在筛选鉴定了致病基因或异常表达基因为病因后， 通过特异性的阻断、干扰、抑制等手段降低或封闭致病基因的表达。
          • 反义核酸(antisense nucleotides)技术、 小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)技术、 miRNA（Micro RNAs）技术 核酶 甲基化寡核苷酸(methylated oligonucleotides，MON)技术
        • 自杀基因治疗
          • 将人体不能合成的药物酶基因转入靶细胞内，该基因表达的产物可以将无毒性的药物前体转化为有毒性的药物，影响细胞的DNA合成，从而引起靶细胞死亡
        • 免疫基因治疗
          • 机体对肿瘤细胞的免疫耐受原因
            • 1、肿瘤细胞本身的免疫原性不强，如HLA表达不足。 2、APC不能提供足够的共刺激信号，如B7(CD80是B7-1, CD86是B7-2)。 3、机体免疫因子分泌不足
          • 用于治疗的免疫基因主要有 细胞因子：TNF-α, INF,IL,CSF HLA B7（CD80/CD86）
    • 反义药物
      • 定义
        • 主要指反义寡核苷酸， 其核苷酸序列可与靶mRNA或靶DNA互补， 抑制或封闭靶基因的表达；与直接作用于致病蛋白的传统药物不同， 反义药物能与特定基因结合，从基因水平上干扰致病蛋白的产生过程，从而达到治疗疾病的目的。
      • 类型
        • 反义核酸
        • 小干扰RNA
        • 核酶
    • 抗肿瘤基因药物
      • 现状
        • 优点：高度特异
        • 重组人p53腺病毒注射液(今又生)
      • 不同给药方式
        • 静脉内注射 静脉内给药是较为常用的一种给药途径；缺点：一方面全身反应，毒副作用大且作用不能持久，另一方面由于肝癌血供主要来自肝动脉，静脉全身给药真正到达肝癌组织发挥作用的有效药物浓度有限。
        • 肝动脉内注射
          • 有效提高肿瘤局部的药物浓度
        • 瘤内注射
        • 门静脉注射
      • 重组人p53腺病毒（今又生）
        • 今又生是由深圳市赛百诺基因技术有限公司研制成功的、拥有自主知识产权的一类新药， 其中发挥抗肿瘤作用的是抑癌基因p53，p53基因是公认的“基因的保护神”， 赛百诺为中国争得了两个世界第一； 通过腺病毒载体将外源性肿瘤抑制基因( p53 基因) 导入肿瘤内，修正导致异常生物学行为的p53 基因缺陷是一种新的抗肿瘤途径。 “今又生” 载体源于第一代人5型腺病毒，为E1 基因缺失的复制缺陷型腺病毒
        • 抗恶性肿瘤作用机制
          • p53 蛋白具有转录因子的功能, 起细胞周期检查点作用, 使受损细胞阻滞于DNA合成前期(G1期) 或DNA合成后期(G2期) 引导细胞凋亡 。 通过 “旁观者效应”，及抑制肿瘤血管生成、提高放疗及化疗药物敏感性等作用来杀伤肿瘤。
        • 旁观者效应：最初源于基因治疗领域，即处理细胞的同时未处理细胞发生损伤，即损伤扩大效应
          • 局部治疗可促使机体发生免疫炎症反应
          • 也可通过胞内释放危险信号诱发机体识别肿瘤的能力，从而影响机体免疫微环境，进而激发机体抗肿瘤免疫反应，实现对非治疗区域的肿瘤细胞杀伤效应
        • 细胞周期检查点：是细胞周期中的一套保证DNA复制和染色体分配质量的检查机制。是一类负反馈调节机制。
          • 当细胞周期进程中出现异常事件，如DNA损伤或DNA复制受阻时，这类调节机制就被激活，及时地中断细胞周期的运行。待细胞修复或排除故障后，细胞周期才能恢复运转。
• 微生物药物
  • 概述
    • 定义和发展
      • 传统抗生素
        • 弗莱明——青霉素
        • Waksman——链霉素
      • 半合成抗生素
        • 利用大肠杆菌青霉素酰化酶裂解青霉素G制成了6-氨基青霉烷酸（6-APA）【母核】；青霉素G结构中含有β-内酰胺酶（青霉素酶）破坏了青霉素β-内酰胺环的结构，使青霉素失去活性。
        • 苯氧甲基青霉素（青霉素V）抗菌效果弱于青霉素G
        • 头孢菌素C化学裂解得到7-氨基头孢烷酸(7-ACA)母核
      • 微生物来源的其他活性物质
        • β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺类抗生素联合使用时，能显著地增强后者的治疗效果；洛伐他汀是羟甲基戊二酰CoA（HMG-CoA）还原酶抑制剂，可以抑制胆固醇的生物合成，有效抑制高胆固醇血症，预防动脉粥样硬化和冠心病；HMG-CoA还原酶是胆固醇合成的限速酶；免疫抑制剂-环孢素A用于临床肾移植，在临床上取得了十分突出的疗效；乌苯美司具有较强的免疫增强作用；血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，能阻断血管紧张素与其受体结合，从而降低血压。
    • 分类
      • 抗生素类、维生素类、氨基酸类、核苷酸类、酶与辅酶类、酶抑制剂、免疫调节剂
  • β-内酰胺类抗生素生产工艺
    • 概述
      • 青霉素类抗生素
        • 母核：6-氨基青霉烷酸(6-APA)， 作用于繁殖期细菌细胞壁的合成；青霉素是弱酸性物质
      • 头孢菌素类抗生素
        • 母核：7-氨基头孢烷酸(7-Amino-cephalosporic acid，7-ACA)
      • 母核上都带有一个羧基，可溶于有机溶剂中，其盐类易溶于极性溶剂如水中。
    • 青霉素的作用机制
      • 青霉素结合蛋白：细菌的细胞膜上及细胞质内具有一些能与青霉素等β-内酰胺类抗生素结合的蛋白，即青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins, PBPs），
      • 细菌的转肽酶就属于PBPs，它是青霉素作用的靶分子。 青霉素与转肽酶共价结合，使之失去活性，从而阻断了细菌细胞壁的合成。转肽酶的底物是N-乙酰胞壁酸，而青霉素含有的高活性的β-内酰胺环就与转肽酶的底物结构相似，转肽酶误将青霉素作为底物结合后，使青霉素的β-内酰胺环被不可逆地打开， 同时转肽酶的丝氨酸活性位点被永久性地封闭，失去活性。
      • 对细菌的致死效应还应包括触发细菌的自溶酶活性
    • 青霉素的制备
      • 生产菌种
        • 产黄青霉
        • 青霉素生产菌株一般在真空冷冻干燥状态下保存其分生孢子
        • 菌种
          • 丝状菌
            • 黄孢子丝状菌
            • 绿孢子丝状菌（常用）
          • 球状菌
      • 生产工艺
        • 溶剂萃取法
  • 其他微生物药物
    • 微生物产生的酶抑制剂
      • β-内酰胺酶抑制剂
        • 细菌产生β-内酰胺酶是对β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因
        • 细菌产生耐药性的机制主要有： 产生钝化酶, 抗生素作用靶点发生变异, 细菌外膜通透性改变, 增强抗生素外排等。
        • 链霉菌的代谢产物中分离得到了克拉维酸，它是一种强的β-内酰胺酶抑制剂
      • 胆固醇生物合成酶抑制剂
        • HMG-CoA合成酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂（洛伐他汀）、鲨烯合成酶抑制剂等
        • 普伐他汀
    • 微生物产生的免疫调节剂
      • 免疫抑制剂
        • 环孢素A-具有较强的免疫抑制作用
      • 免疫增强剂
        • 乌苯美司-从橄榄网状链霉菌的发酵液中分离得到的， 其最主要的抑制靶点为氨肽酶B， 具有抑制肿瘤侵袭转移作用 作用：抑制细胞增殖与诱导细胞凋亡 抑制肿瘤侵袭转移 抑制血管形成 提高机体的免疫力
    • 微生物来源的受体拮抗剂
      • 受体拮抗剂是指能与受体结合，但不具备内在活性的一类物质
      • 血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂能阻断血管紧张素与其受体结合，从而降低血压；Cytosporin A、B、C是血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂；血管紧张素Ⅱ能使全身小动脉收缩而升高血压，此外，还可促进肾上腺皮质分泌醛固酮。
      • 从曲霉分离到的阿斯普尼辛（Asperlicin）是缩胆囊素受体拮抗剂
      • 从链霉菌分离到的六肽类催产素受体拮抗剂，有可能用于延缓早产。
• 生化药物
  • 种类及作用
    • 氨基酸类药物
      • 是否天然存在
        • 蛋白质氨基酸
          • 必需氨基酸
            • 苯丙、蛋、赖、苏、色、亮、异亮、缬氨酸
          • 半必需
            • Arg、His---幼儿时期所需
        • 非蛋白质氨基酸
        • 衍生氨基酸
    • 多肽与蛋白质类药物
    • 核酸类药物
      • 具有天然药物结构的
        • ATP、辅酶A、辅酶I
      • 碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合物
        • 叠氮胸苷（治疗早期艾滋病）
    • 酶类药物
    • 糖类药物
      • 多糖类
        • 植物多糖
          • 黄芪多糖
          • 人参多糖
      • 免疫促进剂，抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射
    • 脂类药物
  • 重要生化药物及其制作工艺
    • 天冬氨酸
      • 结构与性质
        • 纯品为白色菱形叶片状结晶 等电点为2.77，熔点为269~271℃ 溶于水及盐酸，不溶于乙醇及乙醚。
      • 作用与用途
        • L-Asp有助于鸟氨酸循环，促进氨和CO2生成尿素，降低血中氨和CO2，增强肝功能，消除疲劳。
        • L-Asp还是复合氨基酸输液的原料。
      • L-Asp的生成反应
      • 工艺路线
      • 工艺过程
        • 1. 菌种培养
          • 菌种：大肠埃希菌(Escherichia coli)AS l.881 斜面培养基：营养肉汤培养基 摇瓶培养基(%)：玉米浆7.5，反丁烯二酸2.0，MgSO4·7H2O 0.02，氨水调pH6.0 培养温度：37℃
          • 培养结束后，转筒式高速离心收集菌体(含天冬氨酸酶)
        • 2. 细胞固定
          • 试剂
        • 3. 生物反应堆的制备
          • 将含天冬氨酸酶的固定化E.coli装填于固定床式反应器中，制成生物反应堆。
        • 4. 转化反应
        • 5. 产品纯化与精制
    • 肝素与小分子肝素
      • 肝素（heparin，UFH）
        • 结构与性质
          • 肝素是天然抗凝剂，带负电荷； 是一种含有硫酸基的酸性粘多糖；易溶于水； 肝素结构中的N-硫酸基和游离羟基与抗凝血作用密切相关。 在碱性条件下，N-硫酸基相当稳定。硫酸化程度高的肝素具有较高的降脂和抗凝活性。
        • 作用与用途
          • 肝素是抗凝血药 能阻止血液的凝结过程 用于防止血栓的形成
          • 1.抑制凝血酶的作用
            • ATⅢ与凝血酶通过Arg-Ser肽键相结合形成复合物而使凝血酶灭活；一旦肝素-ATⅢ-凝血酶复合物形成，肝素就从复合物上解离，再次与另一分子ATⅢ结合而被反复利用。
          • 2.抑制凝血因子
            • 子主题肝素与ATⅢ结合后使ATⅢ的活性部位暴露， 迅速与Ⅺa、Ⅸa、Ⅹa等结合，抑制它们的活性。
        • 生产工艺
      • 低分子肝素（LMWH)
        • 结构与性质
          • 是普通肝素通过酶或化学方法解聚而产生的
        • 作用
          • LMWH由于分子链较短，不能与ATⅢ与凝血酶同时结合成复合物，保留凝血酶的活性，出血可能性小。 LMWH是通过与ATⅢ结合，抑制凝血因子Xa活性，从而抑制血栓形成。
        • 优点
          • LMWH和UFH具有不同的抗凝血因子Xa/抗Ⅱa比值活性。 UFH的抗凝血因子Xa/抗Ⅱa比值为1:1；LMWH的抗凝血因子Xa/抗Ⅱa比值为2:1~4:1。 由于减少了对凝血因子Ⅱa的抑制作用，LMWH在达到有效抗凝作用的同时，降低了出血风险。
        • 生产工艺
          • 亚硝酸裂解法
    • 天冬酰胺酶
      • 性质与发现
        • 具有酰胺基水解作用的酶 大肠杆菌能产生2种天冬酰胺酶，其中天冬酰胺酶Ⅱ具有抗癌活性。 无抗癌活性的天冬酰胺酶I，存在于细胞质中， 而有抗癌活性的天冬酰胺酶Ⅱ则分泌到细胞周质中
      • 作用
        • 天冬酰胺是细胞合成蛋白质及增殖生长所必需的氨基酸。 正常细胞有天冬酰胺合成酶，具有自身合成天冬酰胺的功能， 而急性白血病等肿瘤细胞则无此功能，用天冬酰胺酶使天冬酰胺急剧缺失时， 肿瘤细胞因既不能从血中取得足够天冬酰胺，亦不能自身合成， 使其蛋白质合成受障碍，增殖受抑制，细胞大量破坏而不能生长、存活。
      • 生产工艺
• 生物药物概述
  • 概念
    • 以动物、植物、微生物和海洋生物为原料制取的各种天然生物活性物质,及其人工合成或半合成的天然物质类似物，应用生物工程技术制造生产的新生物技术药物（new biotech drug）
    • 生物工程技术、基因工程、细胞工程、酶工程与发酵工程
  • 发展简史
    • 传统生物制药阶段
      • 东晋葛洪《肘后备急方》
      • 东晋葛洪《肘后备急方》
      • 炎帝神农是最早应用生物材料制成天然药剂的人
    • 近代生物制药阶段
      • 英国Fleming发现青霉素,为点青霉
    • 现代生物制药阶段
  • 特性与类别
    • 特性
      • 药理学特性
        • 活性强 治疗针对性强 毒副作用一般较少 生理副作用常有发生
      • 理学特性
        • 有效物质含量低、杂质多 生物活性物质组成结构复杂、稳定性差 生物材料易染菌、腐败 注射用药有特殊要求，制品中不能含有热原质
    • 类别
      • 天然生物药物
      • 合成或半合成生物药物
      • 生物技术药物
  • 发展前景
    • 销售额最高6大类生物技术药物
      • 肿瘤治疗用抗体类、抗TNF治疗性抗体、EPO类、胰岛素类、干扰素类和凝血因子类
    • 发展重点
      • 疫苗，治疗性抗体和重组蛋白激素类药物
• 用延胡索酸与铵盐为原料在天冬氨酸酶的催化下生产L-Asp
• 抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）
  • 是凝血酶（凝血因子Ⅱ）及凝血因子Ⅻa、Ⅺa、Ⅸa、Ⅹa等含丝氨酸的蛋白酶的抑制剂。
• 真空共沸结晶作用机理
  • 试剂：醋酸钾-乙醇 反应阶段：青霉素游离酸在醋酸丁酯中的溶解度是很大的，当它与醋酸钾反应成盐之后，青霉素钾易溶于水而不溶于醋酸丁酯。因此，青霉素钾盐在水中达到饱和后，会有细小的晶核析出， 真空蒸发阶段：水-醋酸丁醋-乙醇形成三元共沸物不断馏出，随之青霉素钾盐不断析 出，晶核逐渐长大，形成晶粒。
• 新型疫苗包括基因工程疫苗、合成肽疫苗、遗传重组疫苗、抗独特型抗体疫苗等。
• 人源化单克隆抗体的优点
  • 特异性强； 应用于人体时，不易发生过敏反应及免疫复合物疾病； 在人体内半衰期较长
• 大肠杆菌表达系统生产中分离纯化的技术路线共同点
  • ①粗制提取，包括包涵体的溶解、复性，超滤； ②色谱分离，一般先用离子交换色谱，而后用分子筛色谱，最后用反向色谱处理； ③重结晶，可去除色谱过程中加入的有机溶剂残留物及其他有害杂质。