第三章 细胞生物学的研究方法

第三章 细胞生物学的研究方法：包含细胞形态结构观察方法，细胞及其组分分析方法，模式生物与功能基因组研究，细胞及生物大分子的动态变化等等

细胞生物学的研究方法

• 细胞形态结构观察方法
  • 光学显微镜 p30
    • 普通复式光学显微镜
      • 光学放大系统
        • 目镜、物镜
      • 照明系统
        • 光源、聚光镜、滤光片
      • 镜架及样品调节系统
    • 相差显微镜
      • 观察非染色活细胞
      • 两束光相互干涉，增强反差
      • 密度大则滞留时间长
      • 通过“环状光阑”、“相差板”、将相位差➡️振幅差
    • 微分干涉显微镜
      • 以平面偏振光为光源，两个棱镜折射
      • 适于研究活细胞
      • 加上录像可观察动态过程
    • 荧光显微镜
      • 核心部件
        • 专用物镜镜头
        • 滤光片系统
          • 激发滤光片
          • 阻断滤光片
      • 样品制备技术
        • 免疫荧光技术
        • 荧光素直接标记技术
          • 荧光素DAPI+DNA
            • 同一样品用两种以上的荧光标记可以显示出不同成分在细胞中的定位。
    • 激光扫描共焦显微镜（LSCM）
      • 共焦：只有聚光镜聚焦在样品中某一位点所产生的荧光可以穿过小孔或狭缝，从而产生二维图像。
      • 可通过“光学切片”改变焦平面而获得不同切面图像，得到三维图像。
  • 电子显微镜（EM） p34
    • 基本知识
      • 与光学显微镜区别：光源是电子束
        • 通过电磁透镜聚焦
        • 电镜镜筒高度真空
        • 图像通过荧光屏和感光胶片进行显示、记录
      • 有效放大倍数10^6倍，分辨率0.2nm 空放大：如果通过光学手段继续放大，再也不会得到任何有意义的信息。 实际分辨率受到生物制样技术本身限制。
      • 基本构造
        • 电子束照明系统
          • 电子枪
          • 聚光镜
        • 成像系统
          • 物镜
          • 中间镜
          • 投影镜
        • 真空系统
          • 两级真空泵
        • 记录系统
          • 荧光屏或感光胶片或CCD
    • 电镜制样技术
      • 超薄切片技术
        • 1、固定
          • 化学：固定剂戊二醛、四氧化锇
          • 物理：超低温冷冻
          • 保持样品真实性
        • 2、包埋
          • 环氧树脂，支撑样品
        • 3、切片
          • 玻璃（常用）/钻石刀
        • 4、染色
          • 重金属盐（不同程度地散射和吸收电子，在样品上形成明暗差别）
      • 负染色
        • 重金属盐重金属盐染色经纯化的细胞组分或结构，显示细胞结构组分、病毒。
      • 冷冻蚀刻
        • 1、冰冻断裂 2、蚀刻复型
        • 快速低温冷冻➡️升华（蚀刻）➡️喷镀金属➡️喷镀碳膜➡️消化液消化➡️置于载网上 （无需固定包埋，可以保持样品的真实结构）
        • 在此基础上发展了快速冷冻深度蚀刻技术，用于观察胞质中的细胞骨架纤维及其结合蛋白。
      • 电镜三维重构与低温电镜技术
        • 电镜三维重构
          • 电子显微术、电子衍射与计算机图像处理相结合
          • 适用于分析难以形成三维晶体的膜蛋白及病毒和和蛋白质-核酸复合物等大的复合体的三维结构。
      • 低温电镜技术
        • 在电镜三维重构基础上发展而来，更真实地展示出生物大分子及其复合物表面与内部空间结构，分辨率更高。
        • 不经固定、染色、干燥，直接包被在约100nm厚的冰膜中，在电镜内160摄氏度低温下利用相位衬度成像。
      • 扫描电镜技术（SEM）
        • 低压高分辨扫描电镜分辨率0.7nm，一般扫描电镜为3nma
        • 二氧化碳临界点干燥法处理，观察前喷镀金膜（良好导电性）。 电子枪➡️发射电子➡️磁透镜汇聚成电子“探针”➡️在样品表面“扫描”➡️被激发的样品表面放出二次电子➡️探测器收集，闪烁器转变为光信号。
        • 得到【样品表面】的立体图像信息。 活细胞❌，细胞全貌❌
  • 扫描隧道显微镜（STM） p38
    • 利用隧道效应，探测微观物质表面形貌可直接观察DNA、RNA、蛋白质等生物大分子及生物膜、病毒等结构。
    • x,y,z三个方向扫描等压电陶瓷、逼近装置、电子学反馈控制系统、数据采集、处理、显示系统
    • 主要特点
      • 原子尺度高分辨率，侧0.1-0.2nm，纵0.001nm
      • 在真空、大气、液体等多种条件下工作
      • 非破坏性测量
• 细胞及其组分分析方法
  • 超离心技术分离细胞组分 p39
    • 差速离心：利用不同离心速度产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开。
    • 密度梯度离心
      • 速度沉降：密度相近大小不一的细胞组分
      • 等密度沉降：不同密度的细胞组分
  • 细胞成分的化学显示方法 p40
    • DNA-福尔根反应（紫红色
    • 多糖-PAS反应（紫红色
    • 脂质
      • 四氧化锇（黑色
      • 苏丹III（深红色
    • 蛋白质
      • 米伦反应（氮汞试剂
      • 重氮反应
      • 硫醇盐（蛋白质中-SH基
    • 酶
      • 1、冰冻切片或以冷丙酮、甲醛短时间固定 2、与适宜底物共同温育
      • 碱性磷酸酶-格莫瑞方法
  • 特异蛋白抗原的定位与定性
    • 体内分析
      • 免疫荧光技术
        • 直接免疫荧光标记
        • 间接免疫荧光标记
        • 免疫酶标记技术
      • 免疫电镜技术
        • （与抗体结合标志物不同）
          • 免疫铁蛋白技术
          • 免疫酶标技术
          • 免疫胶体金技术
    • 体外分析
      • 免疫印迹
      • 放射免疫沉淀
      • 蛋白质芯片
      • 质谱分析
  • 细胞内特异核酸的定位与定性 p41
    • 原位杂交技术
      • 用标记的核酸探针通过分子杂交确定核苷酸序列在染色体或者细胞中的位置的方法。
  • 定量细胞化学分析与细胞分选技术
    • 流式细胞术（定量）
      • 某一细胞中DNA、RNA或某一特异标记的蛋白的含量
      • 细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量
      • 将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来
      • 将DNA含量不同的中期染色体分离出来
      • 用于细胞分选
• 模式生物与功能基因组研究
  • 常用模式生物
    • 大肠杆菌（原核生物代表）
    • 酵母（单细胞真核生物代表）
    • 线虫（遗传学分析）
    • 果蝇（遗传学分析）
    • 斑马鱼（许多基因与人类基因存在一对一关系）
    • 小鼠
    • 拟南芥
  • 突变体制备技术
    • DNA
      • 基因敲除
      • 化学诱变法
      • P因子介导的突变
      • 正向遗传学
      • 基于同源重组的定点突变
    • RNA
      • RNA干扰，RNAi，在mRNA层面上阻断了对应基因功能
  • 蛋白质组学技术
    • 蛋白质分离技术
      • 双向凝胶电泳
      • 多维液相色谱
      • 毛细管电色谱
    • 蛋白质鉴定技术
      • 质谱
      • 蛋白质芯片技术
    • 生物信息学
• 细胞及生物大分子的动态变化
  • 荧光漂白恢复技术（FPR） p45
    • 用亲脂性或亲水性荧光分子标记脂质或蛋白质，检测所标记分子在活体细胞表面或内部的运动及其迁移速率。
  • 单分子技术与细胞生命活动的研究 （常组合使用）
    • 单分子光谱成像
    • 单分子操纵及力学性质测量
  • 酵母双杂交技术p46
    • （靶蛋白+DNA结合域）+（搭档蛋白+转录激活域）➡️报告基因转录
    • 可能假阳性（蛋白质A与B非共价结合）
    • 可以研究哺乳动物，也可以研究高等植物
    • 研究活细胞内蛋白质-蛋白质相互作用
  • 荧光共振能量转移技术（FRET）
    • 检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用的重要手段
    • A带荧光，与B结合，能量转移给B，Ａ能量损失，测量Ａ损失量。
  • 放射自显影技术 p48
    • 对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术
      • 同位素标记的生物大分子前体的掺入
      • 细胞内同位素所在位置的显示
• 细胞培养与细胞工程
  • 细胞培养 p42
    • 动物细胞培养
      • 原代细胞、传代细胞 （任何动物细胞培养需从原代细胞培养做起）
      • 细胞贴壁、单层细胞，单层细胞培养
      • 细胞系
        • 有限细胞系
        • 永生细胞系/连续细胞系
      • 细胞克隆、细胞株
      • 悬浮方法培养 （在有限培养液中获得大量细胞）
    • 植物细胞培养
      • 单倍体细胞培养
      • 原生质体培养
        • 植物体细胞去壁培养
        • 用不同植物原生质体进行融合与体细胞杂交，获得体细胞杂交的植株
  • 细胞工程 p43
    • 细胞培养
    • 细胞分化的定向诱导
    • 细胞融合与单克隆抗体技术
      • 细胞融合
        • 动物细胞促融剂：灭活的病毒（如仙台病毒）、化学物质（如聚乙二醇，PEG）
        • 植物细胞需先用纤维素酶去壁
        • 同核体、异核体，合核体
        • 亲缘关系较近的核型比较稳定，染色体丢失较慢
      • 单克隆抗体技术
        • 细胞融合研究基础上建立
        • B淋巴细胞杂交瘤技术
    • 显微操作技术与动物的克隆
      • 细胞拆合技术，形成核质杂交细胞
        • 物理方法
        • 化学方法
• 取样、固定、包埋、切片、染色（H-E，蓝紫核、红细胞质）、观察
• 反向遗传学