基因工程

高中生物：基因工程：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体中，使目的基因与其整合并表达。

基因工程

• 基本
  • 定义
    • 按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
  • 原理
    • 基因拼接理论基础
      • DNA是遗传物质
      • DNA的组成单位都为dNTP
      • DNA的空间结构都是规则的双螺旋结构
    • 外源基因在受体内表达的理论基础
      • 基因是独立遗传单位
      • 遗传信息的传递遵循中心法则
      • 共用一套遗传密码
• 重组DNA技术的基本工具
  • 限制性内切核酸酶 “分子手术刀”
    • 主要来源
      • 从原核生物中分离纯化而来
    • 作用
      • 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中的特定部位的磷酸二酯键断开
      • eg：EcoR I可以识别G↓AATTC，Sma I可以识别CCC↓GGG
    • 切割形式
      • 黏性末端
      • 平末端
  • DNA连接酶 “分子缝合针”
    • 作用
      • 将双链DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
    • 分类
      • E.coli DNA连接酶
        • 来源
          • 从大肠杆菌中分离得到
        • 特点
          • 只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来
      • T4 DNA连接酶
        • 来源
          • 从T4噬菌体中分离得到
        • 特点
          • 既能连接互补的粘性末端，又能连接平末端，但平末端的效率较低
  • 基因进入受体细胞的载体 “分子运输车”
    • 常用载体
      • 质粒、噬菌体和动植物病毒
        • 质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子
    • 要求
      • ①对受体细胞无害且不影响其正常的生命活动
      • ②能在受体细胞中复制并稳定保存
      • ③具有标记基因，以供筛选和鉴别
      • ④具有一个以上的限制酶切点
  • DNA的处提取与鉴定
    • 实验原理
      • ①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质可以——初步分离DNA和蛋白质
      • ②DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液
      • ③DNA遇二苯胺试剂显蓝色
    • 方法
      • 研磨
      • 除杂
        • 过滤后冷却/离心后取上清液
      • 提取
        • 加入95%的酒精溶液后溶液中出现白色丝状物→用玻璃棒卷起/离心后取沉淀物并晾干
      • 鉴定
        • 用二苯胺试剂鉴定——沉淀物/丝状物显蓝色
• 基因工程的基本操作
  • 目的基因的筛选与获取
    • 筛选合适的目的基因
      • 定义
        • 用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因
      • 作用
        • 与生物抗逆性、优良品质、生产药物、无毒降解和工业用酶相关
      • eg
        • Bt抗虫蛋白基因——来自于苏云金杆菌产生的苏云金杆菌伴胞晶体蛋白，可杀死棉铃虫
      • 筛选
        • 从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选合适的目的基因
    • 利用PCR（聚合酶链式反应）获取和扩增目的基因
      • 定义
        • 一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术
      • 基本条件
        • 高温
          • 打开DNA双链
        • DNA母链
          • 提供DNA复制的模板
        • dNTP
          • 提供合成子链的原料
        • DNA聚合酶
          • 催化合成DNA子链
        • 引物
          • 使DNA聚合酶能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
        • ATP
        • 解旋酶
      • 合成方向
        • 从子链的5'端向3'端延伸
      • 反应过程
        • 变性
          • 当温度>90℃时，双链DNA解聚为单链
        • 复性
          • 温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA相结合
        • 延伸
          • 温度下降到72℃左右，ATCG在TaqDNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
  • 基因表达载体的构建
    • 目的
      • 让基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代
      • 使目的基因能够表达和发挥作用
    • 组成
      • 启动子
        • RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
      • 终止子
        • 使转录在所需要的位置停下来
      • 标记基因
        • 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
      • 目的基因
      • 复制原点
    • 构建过程
      • ①用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口
      • ②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
      • ③利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成一个重组DNA分子
    • 真核细胞基因的基本结构
      • • 逆转录产生的目的基因中没有内含子、启动子和终止子，故原核细胞中的RNA聚合酶无法识别真核基因的启动子序列
    • tips
      • 可以利用双酶切的方法防止其倒连或自连
  • 将目的基因导入受体细胞
    • 导入植物细胞
      • 花粉管通道法
        • 方法
          • 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房
          • 授粉后剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
      • 农杆菌转化法
        • 步骤
          • ①将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，获得含目的基因的重组质粒
          • ②将此重组质粒转入农杆菌，获得重组质粒的农杆菌
          • ③将此农杆菌导入植物受体细胞
          • ④T-DNA转移至受体细胞并将目的基因整合到受体细胞的DNA染色体上，稳定维持和表达
      • 基因枪法
        • 利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体中，使目的基因与其整合并表达
    • 导入动物细胞
      • 显微注射法
        • 利用显微注射仪进行显微注射，将目的基因注射到动物的受精卵中，再移植到雌性动物的输卵管或子宫内，进而使其发育形成具有新性状的动物
    • 导入微生物细胞
      • Ca²⁺处理法
        • 用Ca²⁺处理细胞，使之成为感受态细胞并吸收外围环境中的DNA分子，进而完成转化
  • 目的基因的检测与鉴定
    • 分子水平
      • 导入
        • PCR技术 检测受体细胞的染色体上是否插入了目的基因
      • 转录
        • PCR技术 检测目的基因是否转录出了mRNA
      • 翻译
        • 抗原-抗体杂交技术 检测目的基因是否翻译出了特定的蛋白质
    • 个体水平
      • 抗虫植物——害虫吞噬——害虫是否死亡
      • 抗病植物——病毒感染——是否出现病状
      • 抗盐/除草剂植物——盐水/除草剂浇灌——是否正常生长
      • 获取目的基因产物的基因生物——提取并与天然产品进行比较——是否正常
• 基因工程的应用
  • 农牧业
    • 改良植物品质
      • 转基因抗虫植物
      • 转基因抗病植物
      • 转基因抗除草剂植物
      • 改良植物的品质
    • 改良动物的品质
      • 提高动物的生长速率
      • 改善畜产品的品质
  • 医药卫生
    • 利用转基因微生物和动植物生产药物
    • 利用哺乳动物批量生产药物
      • 乳腺（房）生物反应器
    • 实现建立移植器官工厂的设想
    • 基因治疗
      • 体外治疗
        • 基因缺陷病毒离体→体外转化并扩增→会输体内 （淋巴细胞）
      • 体内治疗
        • 将携带正常基因的载体直接转入患者组织细胞中 （肺组织）
  • 食品工业
    • 工业用氨基酸
    • 工业用酶
• 人间毫无留恋，一切散为烟
• 从基因文库中分离目的基因
  • • cDNA中基因：基数小、基因短