2 生物化学第四版 氨基酸、肽、蛋白质

氨基酸，是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物。羧酸碳原子上的氢原子被氨基取代后形成的化合物。 氨基酸分子中含有氨基和羧基两种官能团。

氨基酸、肽和蛋白质

• 一、氨基酸——蛋白质的单体亚基
  • （一）蛋白质的水解
    • 酸水解
      • 一般用6mol/L的HCl或4mol/L的硫酸进行水解
        • 优点：不引起外消旋，得到的是L-氨基酸。
        • 缺点：色氨酸完全被沸酸所破坏
        • 缺点：羟基氨基酸（丝氨酸和苏氨酸）有一小部分被分解，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。
    • 碱水解
      • 通常与5mol/L氢氧化钠共煮10-20h即可使蛋白质完全水解
        • 缺点：水解过程中，多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋
        • 缺点：所得产物是D-和L-氨基酸的混合物
        • 碱水解引起精氨酸的脱氨，生成鸟氨酸和尿素
        • 优点：在碱性条件下，色氨酸是稳定的
    • 酶水解
      • 不产生消旋作用，也不破坏氨基酸
      • 使用一种酶，往往水解不彻底
      • 所需时间较长
  • （二）α—氨基酸的一般结构
    • 参与蛋白质组成的20种常见氨基酸（19种氨基酸和1种亚氨基酸即脯氨酸）
    • α-氨基酸作为蛋白质构件分子的原因
    • 蛋白质中发现的氨基酸都是L型的
• 二、氨基酸的分类
  • （一）常见的蛋白质氨基酸
    • 非极性脂肪族R基氨基酸
      • R基是非极性的、疏水的
        • 甘氨酸/glycine/Gly/G
          • 唯一不含手性碳原子的氨基酸，不具有旋光性
        • 脯氨酸/proline/Pro/P
          • α-亚氨基酸，具有一个特殊的环状结构的脂族侧链
        • 丙氨酸/alanine/Ala/A
        • 缬氨酸/valine/Val/V
        • 亮氨酸/leucine/Leu/L
        • 异亮氨酸/isoleucine/ ILE/ I
        • 在蛋白质分子内倾向于成串聚集，借疏水相互作用稳定蛋白质的结构
        • 甲硫氨酸（蛋氨酸）/methionine/Met/M
          • 侧链中含有一个非极性的硫醚键，是体内代谢中甲基的供体
    • 芳香族R基氨基酸
      • 具有芳香族侧链的氨基酸是非极性的、疏水的
        • 苯丙氨酸/phenylalanine/Phe/F
        • 酪氨酸/tyrosine/Tyr/Y
          • 羟基能形成氢键
        • 色氨酸/tryptophan/Trp/W
          • 吲哚环氮
        • 都参与疏水相互作用。酪氨酸和色氨酸的极性比苯丙氨酸大。都有吸收紫外光的能力。（280nm波长）
    • 极性不带电荷的R基氨基酸
      • 比非极性氨基酸在水中的溶解度大、亲水性大
        • 丝氨酸/serine/Ser/S
          • 极性来自羟基
        • 苏氨酸/threonine/Thr/T
          • 极性来自羟基
        • 半胱氨酸/cysteine/Cys/C
          • 极性来自巯基
        • 天冬酰胺/asparagine/Asn/N
          • 极性来自酰胺基
        • 谷氨酰胺/glutamine/Gln/Q
          • 极性来自酰胺基
        • 含有能跟水形成氢键的官能团
    • 带正电荷的（碱性）R基氨基酸
      • 赖氨酸/lysine/Lys/K
      • 精氨酸/arginine/Arg/R
      • 组氨酸/histidine/His/H
        • 由于起着质子供体/接纳体的作用，使许多酶促反应变得容易发生
    • 带负电荷的（酸性）R基氨基酸
      • 天冬氨酸/aspartic acid/Asp/D
      • 谷氨酸/glutamic acid/Glu/E
      • 天冬氨酸和谷氨酸都含有两个羧基
  • （二）不常见的蛋白质氨基酸
    • 由已参入多肽链的相应的常见氨基酸残基修饰而来
      • 4-羟脯氨酸
        • 5-羟赖氨酸
          • 6-N-甲基赖氨酸
            • γ-羧基谷氨酸
  • （三）非蛋白质氨基酸
    • 不参与蛋白质组成
      • 大多是L型α氨基酸的衍生物，有些是β-、γ-或δ-氨基酸，有些是D型氨基酸。
      • D谷氨酸
      • D丙氨酸
      • 细菌细胞壁的肽聚糖中发现
• 三、氨基酸的酸碱性质
  • （一）氨基酸的解离
    • 占优势的分子形式是兼性离子
    • 任一官能团的pKa都受到它的化学环境影响
    • 红细胞中运输氧气的血红蛋白由于含有较多的组氨酸残基，使得它在pH 7左右的血液中具有显著的缓冲能力，这一点对红细胞在血液中起运输氧气和二氧化碳的作用来说是重要的
  • （二）氨基酸的等电点
    • 氨基酸处于净电荷为零时的特征pH称为等电点或等电pH，缩写pI
    • pI=½（pK1+pK2），pI与该离子浓度基本无关，只决定于等电兼性离子两侧的pKa
    • 在等电点以上的任意pH，氨基酸带净负电荷，并因此在电场中将向正极移动，在低于等电点的任意pH，氨基酸带有净正电荷，在电场中将向负极移动
    • 氨基酸溶液的pH离等电点越远，氨基酸所携带的静电荷越大
• 四、氨基酸的化学反应
  • （一）α—羧基参加的反应
    • 酯化
    • 酰氯化
    • 酰胺化
  • （二）α—氨基参与的反应
    • 氨基酸的游离α-氨基可被酰氯或酸酐酰化。
    • 游离氨基也能与烃化剂如2,4-二硝基氟苯（DNFB）或苯异硫氰酸酯（PITC）等发生反应。DNFB和PITC被用于肽和蛋白质的氮端氨基酸残基鉴定和氨基酸序列测定。
    • 游离氨基能与醛反应生成弱碱，称为西佛碱。西佛碱是以氨基酸为底物的某些酶促反应的中间产物。
  • （三）α—羧基和α—氨基共同参加的反应
    • 成肽反应
    • 与茚三酮反应
      • 可检测和定量氨基酸，在氨基酸分析中占有特殊地位。采集指纹
      • 不是氨基酸的特有反应
      • 反应关键位置在氨基和羧基
      • 脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质，最大光吸收在440nm。其余氨基酸与茚三酮反应均产生蓝紫色物质，可用分光光度计在570nm波长进行定量测定。
  • （四）侧链官能团参加的反应
    • 化学修饰是指在较温和的条件下，以可控制的方式，使蛋白质与某种试剂（化学修饰剂）起特异反应，以引起蛋白质中个别氨基酸残基侧链官能团发生共价化学改变。
      • Pauly反应
• 五、氨基酸的旋光性和光谱性质
  • （一）氨基酸的旋光性和立体化学
    • 组成蛋白质的氨基酸都是L型的，但自然界中也存在D型氨基酸，作为某些抗生素和某些微生物的细胞壁成分存在。
  • （二）氨基酸的光谱性质
    • 在近紫外区（200-400nm）只有芳香族氨基酸有吸收光的能力。蛋白质具有紫外吸收能力，一般最大吸收在280nm
      • R基含有苯环共轭π键系统
• 六、氨基酸混合物的分析和分离
  • （一）分配层析
    • 基本原理：基于氨基酸的溶解度性质
    • 主要种类
      • 柱层析
        • 用于样品鉴定和制备分离
      • 纸层析
      • 薄层层析
        • 分辨率高，所需样品量微，层析速度快，可使用的支持剂种类多
    • 所有层析系统都由两个相组成：固定相和流动相
      • 混合物在层析系统中的分离，决定于该混合物的组分在这两相中的分配情况及，即决定于它们的分配系数
      • 当一种溶质在两个给定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数，称分配系数
  • （二）离子交换层析
    • 是一种基于氨基酸电荷行为的层析方法，层析柱中填充的是离子交换树脂，它是具有碱性或酸性基团的人工合成聚苯乙烯-二乙烯等不溶性高分子化合物。树脂一般都制成球形的颗粒。
    • 氨基酸在树脂上结合的牢固程度即氨基酸与树脂间的亲和力，主要决定于它们之间的静电吸引
    • 在ph 3左右，氨基酸与阳离子交换树脂之间的静电吸引的大小次序是碱性氨基酸＞中性氨基酸＞酸性氨基酸，因此，氨基酸洗出顺序，大体上是酸性氨基酸、中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。
    • 为了使氨基酸从树脂柱上洗脱下来，需要降低他们之间的亲和力，有效的方法是逐步提高洗脱剂的ph和盐浓度（离子强度），这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来
• 七、肽
  • （一）肽和肽键的结构
    • 肽键是由一个氨基酸的α—羧基和另一个氨基酸的α—氨基，除去一分子水缩合而成
    • 二硫键和二硫桥
    • 六个原子差不多处于同一平面内，称为肽平面
    • 蛋白质中的肽键一般都是反式构型
  • （二）肽的物理和化学性质
    • 氮端的氨基酸残基能与茚三酮发生定量反应，生成呈色物质，这一反应用于肽的定性和定量。
    • 双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而氨基酸所没有的一个颜色反应
      • 二肽没有此反应
  • （三）天然存在的活性肽
    • 自然界中活性肽的形成有两条途径，一条是通过核糖体的途径，例如一些激素；另一条是不通过核糖体的途径，例如细菌和低等真菌产生的肽类抗生素。
    • 催产素
      • 加压素
    • α—鹅膏蕈碱
      • 鹅膏蕈碱能与真核生物的RNA聚合酶Ⅱ牢固结合而抑制酶的活性，因而使RNA的合成不能进行，但不影响原核生物的RNA合成
    • 谷胱甘肽GSH
      • 没有编码GSH的基因
      • 还原型谷胱甘肽在红细胞中作为巯基缓冲剂存在，维持血红蛋白和红细胞其他蛋白质的半胱氨酸残基处于还原态
• 八、蛋白质的组成，分类，分子大小和结构层次
  • （一）蛋白质的化学组成和分类
    • 蛋白质含量=蛋白氮×6.25
    • 根据蛋白质组成成分分类
      • 简单蛋白质
        • 缀合蛋白质
    • 根据蛋白质的生物学功能分类
      • 酶、调节蛋白、转运蛋白、贮存蛋白、收缩和游动蛋白、结构蛋白、支架蛋白、防卫和保护蛋白。
    • 根据形状和溶解度分类
      • 纤维状蛋白质
        • 球状蛋白质
          • 膜蛋白
  • （二）蛋白质分子的形状和大小
    • 单体蛋白质
      • 蛋白质仅由一条多肽链构成
    • 寡聚蛋白质/多聚蛋白质
      • 蛋白质由两条或多条多肽链构成
        • 多肽链通过非共价力缔合（每条多肽链称为亚基）
        • 多肽链通过二硫键结合（不称为亚基，称为链）
  • （三）蛋白质分子结构的组织层次
    • 一级结构
      • 通常是指蛋白质肽链的氨基酸残基的序列或氨基酸序列；缀合蛋白质一级结构还应包括共价连接的辅基部分。一个蛋白质分子为获得复杂结构所需的全部信息都含于一级结构中。
        • 共价键
    • 二级结构
      • 是指肽链主链中局部肽段，借助氢键形成的周期性结构，包括α-螺旋、β-折叠、β-转角等。
        • 氢键
    • 过渡性结构层次
      • 超二级结构和结构域
        • 并不是每种蛋白质都一定存在过渡结构层次
    • 三级结构
      • 是指多肽链借非共价力折叠成具有特定走向的完整球状实体
        • 次级键：范德华力，离子键，疏水作用，氢键，二硫键，配位键
    • 四级结构
      • 是指具有三级结构的亚基借助非共价力，彼此合成寡聚蛋白质，或者表述为寡聚蛋白质中各亚基之间的相互关系和结合方式
        • 疏水作用
• 九、蛋白质的一级结构
  • （一）蛋白质的氨基酸【残基】序列决定蛋白质的功能
    • 功能决定于三维的立体结构，立体结构决定于一维的线性氨基酸序列。
    • 第一：具有不同功能的蛋白质具有不同的氨基酸序列
    • 第二：蛋白质的一级结构改变，其功能也可能发生改变
      • 例如人类遗传病：镰状细胞贫血病、杜兴氏肌营养良症
    • 第三：不同物种中功能相同或相似的蛋白质，经常具有相似的氨基酸序列，这些蛋白质被称为同源蛋白质。
      • 例如从果蝇和人这样完全不同的物种中提取的泛素，氨基酸序列是一样的
    • 三条经验线索
    • 特定蛋白质的氨基酸序列不是绝对固定的，具有一定的可变性或柔性。
  • （二）蛋白质一级结构的举例
    • 胰岛素
    • 牛胰核糖核酸酶/核糖核酸酶A
    • 血红蛋白
  • （三）蛋白质序列数据库
  • （四）蛋白质化学测序的策略
    • 测定蛋白质的一级结构，要求样品必须是均一的，纯度应在97%以上，同时必须知道它的相对分子质量，误差允许在10%左右
    • 步骤
      • 1.确定蛋白质分子中不同多肽链的数目
        • 2.拆分蛋白质分子的多肽链
      • 3.断裂多肽链内部的二硫键
        • 4.分析每一多肽链的氨基酸组成
      • 5.鉴定多肽链的N端和C端残基
        • 6.裂解多肽链成较小的片段
      • 7.测定各肽段的氨基酸序列
        • 8.重建完整多肽链的一级结构
      • 9.确定二硫键的位置
• 十、蛋白质测序的一些常用方法
  • （一）末端残基分析
    • N端残基
      • 二硝基氟苯FDNB标记，生成DNP-多肽
        • 纸层析、薄层层析、高效液相色谱法鉴定
      • 丹磺酰氯、达磺酰氯具有强烈的荧光基团，生成的衍生物比DNP衍生物更易检测
    • C端残基
      • 羧肽酶能专一的从肽链的C端逐个降解
        • 羧肽酶A能水解除Pro、Arg、Lys以外的所有氨基酸
        • 羧肽酶B只能水解Arg和Lys
        • 混合后能水解除Pro以外的所有氨基酸C端
  • （二）二硫键的断裂
    • 氧化法
      • 强氧化剂：过甲酸
    • 还原法
      • 还原剂：巯基化合物，二硫苏糖醇
  • （三）氨基酸组成的分析
    • 主要是酸水解，辅以碱水解（测定色氨酸）
      • 样品完全水解后用氨基酸自动分析仪进行测定
  • （四）多肽链的部分裂解
    • 胰蛋白酶
      • 只断裂Lys或Arg的羧基侧肽键
    • 胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）
      • Phe、Trp、Tyr的羧基侧肽键
    • 溴化氰
      • Met羧基侧
    • 断裂后得到的肽段混合物，通过凝胶过滤、凝胶电泳、HPLC等方法进行分离纯化
  • （五）肽段氨基酸序列的测定
    • Edman化学降解法
      • 苯异硫氰酸酯PITC
        • 与肽链反应只标记和除去一个N端残基，肽链的其余肽键不被水解，N端残基被除去并鉴定后，剩下的肽链暴露出一个新的N端残基，可与PITC发生第二轮反应
    • 质谱法（MS）
      • 可用来测定高精度的分子质量，同时通过测定样品分子裂解产生的一些碎片质量，可以获得有价值的结构信息
        • 电子喷雾离子化
        • 基质辅助激光解吸离子化
    • 根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基酸序列
  • （六）肽段在原多肽链中的次序的确定（氨基酸全序列的重建）
  • （七）二硫键位置的确定
    • 蛋白水解酶水解
      • 胃蛋白酶断裂含二硫键的蛋白质样品
    • 对角线电泳
• 十一、氨基酸序列与生物进化
  • （一）序列的同源性、同源蛋白质和蛋白质家族
  • （二）同源蛋白质氨基酸序列的物种差异
  • （三）同源蛋白质具有共同的进化起源
• 十二、肽和蛋白质的化学合成：固相肽合成