第六章：芳酸类非甾体抗炎药物的分析

人民卫生出版社《药物分析》第六章：芳酸类非甾体抗炎药物的分析，全重点整理，小伙伴们赶快1学习起来吧~

芳酸类非甾体抗炎药物的分析

• 概述
  • 对具体药物的分析
    • 药物结构→性质→分析方法→定性鉴别/含量测定
    • 药物合成工艺路线+药物的稳定性→药物的杂质检查项目
  • 芳酸类非甾体抗炎药物（NSAIDs）
    • 一类不含有甾体骨架的抗炎药物，是目前临床使用最多的药物种类之一
    • 临床疗效
      • 用于风湿性关节炎和类风湿关节炎、多种发热和各种慢性疼痛，如头疼、关节肌肉疼痛、牙疼等症状的缓解
    • 结构共性
      • 本类药物多数具有芳酸基本结构，即芳基取代羧酸结构。根据芳基和羧酸的取代位置及芳基上的取代基的不同，可分为水杨酸类、邻氨基苯甲酸、邻氨基苯乙酸、芳基丙酸、吲哚乙酸及苯并噻嗪甲酸等六类
• 典型药物分类与理化性质
  • 分类
    • 水杨酸类
      • 常见药物
        • 
      • 鉴别特征
        • • 1、游离羧基
            • 酸性，可酸碱滴定测定含量
          • 2、乙酰基
            • 可水解，水解后生成水杨酸，利用水解反应及水解产物进行鉴别
            • 水解反应还可进行含量测定
          • 3、苯环
            • 较强的共轭体系，明显的紫外吸收，紫外分光光度法进行鉴别和含量测定
            • 有机药物，红外光谱专属，红外光谱法鉴别
    • 邻氨基苯甲酸类
      • 常见药物
      • 鉴别特征
        • 邻位效应，羧基酸性增强，可酸碱滴定测定含量
        • 两个苯环共轭，一定条件下显示明显荧光，可用于鉴别
    • 邻氨基苯乙酸类
      • 常见药物
      • 鉴别特征
        • 羧基成钠盐，通过焰色反应定性鉴别
        • 苯环共轭体系，可采用紫外分光光度法定性定量
        • 氯元素通过氧瓶燃烧后卤化银沉淀鉴别
        • 羧基不直接结合于苯环，酸性较弱，强碱弱酸盐，通过非水碱量法定量
    • 芳基丙酸类
      • 常见药物
        • 
      • 鉴别特征
        • 羧基不直接结合于苯环，酸性较弱，但仍可通过酸碱滴定测定含量
        • 酮洛芬含有二苯甲酮结构，可与苯肼显色，用于定性鉴别
    • 吲哚乙酸类
      • 常见药物
      • 鉴别特征
        • 羧基不直接连接苯环，酸性较弱
        • 酰胺键可水解，水解反应、水解产物可用于定性
        • 氯元素可通过卤素鉴别试验来鉴别药物
        • 吲哚美辛共轭体系大，紫外红外特性均可作为定性定量方法
    • 苯并噻嗪甲酸类
      • 常见药物
        • 
      • 鉴别特征
        • 分子结构中没有游离的羧基，通过烯醇式羟基显弱酸性，通过酸碱滴定定量
        • 酰胺键易水解，速度快，通过酰胺键的水解反应鉴别及含量测定
        • 分子中含有S元素，可碱性破坏后与铅沉淀反应用于鉴别
        • 共轭体系，紫外红外特性均可作为定性定量方法
    • 其他非甾体抗炎药
      • 尼美舒利
      • 对乙酰氨基酚
        • 游离酚羟基与三价铁发生颜色反应，用作定性鉴别
        • 乙酰化的氨基通过水解生成芳伯氨基，发生重氮化偶合反应，进行定性鉴别
        • 红外紫外特性
        • 无可供直接滴定的官能团，多采用紫外分光光度法进行含量测定
  • 理化性质
    • 酸性
      • 药物因分子结构中具有游离羧基显酸性，酸性强度受取代基影响
      • 水杨酸类、邻氨基苯甲酸类较强；邻氨基苯乙酸类、芳基丙酸类较弱；其他无明显酸性
    • 水解性
      • 酯键、酰胺键等
      • 水杨酸类可水解酯键；吲哚美辛，吡罗昔康，美洛昔康，对乙酰氨基酚具有酰胺键，可发生水解反应，并用于鉴别和定量
    • 吸收光谱特性
      • 紫外和红外特征光谱用于鉴别和制剂检查
    • 基团或元素特性
      • 酚羟基可与三价铁形成有色配位化合物；酮洛芬的二苯甲酮可与苯肼缩合显色；美洛昔康的硫元素鉴别
• 鉴别试验
  • 酚羟基与三氯化铁反应
    • 水杨酸及其盐
      • 反应条件
        • 弱酸性（pH4~6）
      • 反应现象
        • 紫堇色
    • 阿司匹林
      • 需加热水解后与三氯化铁反应
        • 取本品本品0.1g，加水10ml，煮沸放冷后加入三氯化铁一滴，显紫堇色
    • 发生酚羟基反应的其它药物
      • 对乙酰氨基酚
        • 反应试剂
          • 三氯化铁
        • 反应现象
          • 蓝紫色
      • 双水杨酯
        • 紫色
      • 二氟尼柳
        • 深紫色
    • 吡罗昔康和美洛昔康
      • 烯醇式羟基具有酚羟基性质，在三氯甲烷溶液中与三氯化铁生成红色配合物
      • 吡罗昔康显玫瑰红色，美洛昔康显淡紫红色
  • 缩合反应
    • 二苯甲酮结构，在酸性条件下与二硝基苯肼缩合生成橙色偶氮化合物
  • 重氮化-偶合反应
    • 对氨基水杨酸钠具芳伯氨基结构，在酸性溶液中，与亚硝酸钠液进行重氮化反应，生成的重氮盐与碱性β-萘酚偶合产生橙红色沉淀
  • 其他反应
    • 水解反应
      • 阿司匹林与碳酸钠试液反应
        • 反应现象
          • 水杨酸白色沉淀析出，并产生醋酸的臭气
    • 特征元素的反应
      • 氯元素的反应
        • 氧瓶燃烧后与硝酸银反应，生成白色沉淀
      • 硫元素的反应
        • 分解产生硫化氢，遇醋酸铅黑色沉淀
  • 光谱法
    • 紫外吸收光谱
      • 方法
        • 最大吸收波长法
          • 紫外光谱图上有如图四个最大吸收波长，即证明药物为萘普生
        • 最大与最小吸收波长法
          • 紫外光谱图上有如图两个最大吸收波长、两个最小吸收波长，即为布洛芬
        • 吸光度法
          • 与279nm及350nm处的吸光度值符合要求，即证明药物为甲芬那酸
        • 吸光度比值法
    • 红外吸收光谱法
      • 专属性强，绝大多数原料药均可通过此法鉴别
      • 阿司匹林：本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致
  • 色谱法
    • 薄层色谱法
      • 制剂中药物鉴别时，为了去除辅料干扰，采用TLC法
      • 二氟尼柳胶囊鉴别
        • 固定相
          • 硅胶GF254
        • 展开剂
          • 正己烷-二氧六环-冰醋酸（85:10:5）
        • 检测
          • 254nm紫外灯下检测Rf值
    • 高效液相色谱法
      • 制剂中药物鉴别和有关物质检查常用方法，要求药物含量测定采用高效液相色谱法
      • 要求药物的保留时间与对照品一致
      • 二氟尼柳片鉴别采用HPLC法，因为含量测定为HPLC法
• 有关物质与检查
  • 特殊杂质最主要的来源为生产过程，与药物的合成路线相关
  • 阿司匹林中游离水杨酸与有关物质的检查
    • 阿司匹林（ASA）合成工艺
      • 水杨酸乙酰化不完全，成品中带有水杨酸，因此杂质检查必须检查水杨酸
    • 有关物质
      • 除了起始原料苯酚外，还包括一系列的合成中间体和副产物
      • 药典中通过溶液澄清度检查和有关物质的HPLC检查法进行控制
    • 游离水杨酸的检查
      • 来源及危害
        • 乙酰化反应不完全，药物中会带入水杨酸；成品阿司匹林在放置过程中会水解产生水杨酸
        • 游离水杨酸对人体有毒性，且酚羟基在空气中易被氧化，产生一系列有色的醌类化合物，而使阿司匹林变色，所以需严格控制水杨酸含量
      • 检查方法
        • 目视比色法
          • 水杨酸中的酚羟基在弱酸性条件下与三价铁形成紫红色的配位化合物，而相同条件下阿司匹林不发生反应，通过与对照液相同条件下颜色深浅的比较，控制限量
          • 《中国药典》2005版
            • 取本品0.10g，加乙醇1mL溶解后，加冷水适量使成50mL，立即加新制的稀硫酸铁铵溶液[ 取盐酸溶液（9→100）1mL，加硫酸铁铵指示液2mL后，再加水适量使成100mL ]1ml，摇匀；30秒钟内如显色，与对照液（精密称取水杨酸0.1g，加水溶解后，加冰醋酸1mL，摇匀，再加水使成1000mL，摇匀，精密量取1mL，加乙醇1mL、水48mL与上述新制的稀硫酸铁铵溶液1mL，摇匀）比较，不得更深：0.1%
          • 显色反应对时间控制严格是为了防止阿司匹林在测定中发生水解，产生游离水杨酸
          • 目视比色法存在一定的缺陷
        • HPLC法
          • 《中国药典》2010/2015版
            • 取本品约0.1g，精密称定，置10mL量瓶中，加1％冰醋酸的甲醇溶液适量，振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取水杨酸对照品约10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加1％冰醋酸的甲醇溶液适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，至50mL量瓶中，用1％冰醋酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
            • C18柱，流动相乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水（20:5:5:70），检测波长为303nm。立即精密量取对照品溶液与供试品溶液各10μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与水杨酸峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得超过0.1%
    • 溶液澄清度检查
      • 检查药物中不含有游离羧基、不溶于碱性溶液中的物质
        • 醋酸苯酯、水杨酸苯酯、乙酰水杨酸苯酯
      • 取本品0.50g，加温热至约45℃的碳酸钠试液10mL溶解后，溶液应澄清
        • 供试品溶液的澄清度与所用溶剂相同，或不超过0.5号浊度标准液的浊度
    • 有关物质的检查
      • 阿司匹林中的有关物质指除游离水杨酸之外其他未命名的相关杂质
      • 《中国药典》2015版采用HPLC法-主成分自身对照法对阿司匹林原料药中的有关物质进行检查
      • 溶液配制
        • 供试品溶液
          • 10mg/mL阿司匹林，1%冰醋酸甲醇溶液
        • 对照品溶液
          • 供试品溶液稀释200倍，50μg/mL阿司匹林，1%冰醋酸甲醇溶液
        • 灵敏度溶液
          • 对照品溶液稀释10倍，5μg/mL阿司匹林，1%冰醋酸甲醇溶液
        • 水杨酸对照品液
          • 配置方法同游离水杨酸检查
      • 色谱条件
        • C18柱，梯度洗脱，检测波长为276nm
      • 结果
        • 阿司匹林供试品色谱图中除了主峰阿司匹林之外，还有水杨酸色谱峰，可与水杨酸溶液色谱图中主峰对比确定。其他色谱峰即为有关物质的色谱峰
        • 灵敏度溶液中阿司匹林浓度为5μg/mL，药典规定，若供试品溶液中组分峰面积小于灵敏度溶液的峰面积，则此种组分可忽略不计。故4号峰代表的物质可忽略不计，3号峰代表的物质不可忽略
        • 药典规定，除水杨酸外，其他各杂质峰面积的和不得大于对照溶液峰的峰面积。即3号峰峰面积要小于6号峰
  • 对乙酰氨基酚中对氨基酚的检查
    • 方法
      • 离子对反相HPLC法
        • 离子对色谱
          • 基本原理
            • 在固定相上涂渍对离子或直接将对离子加入流动相内与被分析的样品离子生成中性离子对，增加了被测样品组分在固定相中的溶解度，使被测组分的分配系数增大，达到样品组分分离测定的目的
          • 适用条件
            • 在反相HPLC不保留或保留很差
            • 化合物带有强离子官能团，如磺酸基、羧基、铵基、胺基等
            • 化合物在反相流动相中有足够的溶解度
        • 反相离子对色谱
          • 常用试剂
            • 分析酸类或带负电荷的药物时，常用季胺盐如四丁基铵作离子对试剂
            • 分析碱类或带正电荷的药物时，常用磺酸盐类如庚烷磺酸盐和烷基硫酸盐类如十二烷基硫酸盐等
            • 有机改性剂的选择：多数反离子在甲醇中的溶解度大于乙腈中溶解度
          • 关键要素
            • 离子对试剂浓度与样品浓度比例
              • 离子对的浓度是控制反相离子对色谱溶质保留值的主要因素 ，一般离子对试剂的浓度比样品浓度至少大4倍，通常对离子的浓度为5~10mmol/L
            • 流动相的pH值和缓冲盐的浓度
              • 调解流动相的pH值可在较大范围内，改变弱酸或弱碱样品的保留值和分离选择性。通常测定酸性物质时pH大于目标物pKa约两个单位；测定碱性药物时pH值应小于目标物pKa约两个单位
    • 色谱条件
      • 离子对试剂-四丁基氢氧化铵1.2%，C8柱，以磷酸盐缓冲液-甲醇（90:10）为流动相，245nm波长处检测
    • 限度
      • 对氨基酚采用杂质对照品对照法，限量0.005%；有关物质采用主成分自身对照法，单个杂质限量为0.1%，总量不得超过0.5%
• 含量测定
  • 测定原理
    • 酸碱滴定
      • 芳酸类非甾体抗炎药物分子结构中多含有游离羧基显酸性
    • 紫外-可见分光光度法
      • 药物分子结构中的芳环及其取代基有紫外吸收特性，对制剂来说可使用紫外-分光光度法
    • HPLC法
      • 制剂中含有各种辅料，为提高方法的专属性，制剂大多选用HPLC法
  • 分类
    • 原料药测定法
      • 直接酸碱滴定法
        • 药典规定，原料药首选容量分析法进行含量测定
        • 阿司匹林原料药的含量测定
          • 原理
            • 利用游离羧基的酸性，以标准碱溶液直接滴定
          • 方法
            • 滴定液
              • NaOH（0.1mol/L）
            • 溶剂
              • 中性乙醇
            • 指示液
              • 酚酞
          • 过程
            • 产物为强碱弱酸盐，宜选用碱性范围变色的酚酞为指示剂
            • 反应摩尔比
              • 1:1
            • 滴定度
              • 18.02mg/mL
          • 具体操作
            • 《中国药典》2015版
              • 取本品约0.4g，精密称定，加中性乙醇（酚酞指示液显中性）20mL溶解后，加酚酞指示液3滴，用NaOH滴定液（0.1mol/L）滴定
      • 返滴定法
        • 美洛昔康含有与羰基共轭的烯醇式羟基，具有羧酸性质，显酸性，可用NaOH滴定
        • 由于药物在水、乙醇中溶解度较差，需先用定量过量的NaOH滴定液溶解后，用盐酸滴定液回滴剩余的碱，称为返滴定法
        • 需做空白试验校正
      • 水解后剩余量滴定法
        • 阿司匹林酯结构在直接用NaOH滴定时也会发生水解，使测定结果产生偏差。因此采用水解后剩余量滴定法，显著提高测定准确度和精密度
        • 原理
          • 在供试品溶液中先定量加入过量的NaOH滴定液，加热使药物水解后，用酸滴定液回滴剩余的NaOH滴定液
          • 需做空白试验校正
        • 反应过程
        • 具体操作
          • 美国药典规定
            • 取本品约1.5g，精密称定，加NaOH滴定液（0.5mol/L）50.0mL，混合，缓缓煮沸10min，放冷，加酚酞指示剂，用硫酸滴定液（0.25mol/L）滴定，并将滴定结果用空白试验校正。每mLNaOH滴定液（0.5mol/L）相当于45.04mg阿司匹林
    • 药物制剂分析法
      • 两步滴定法
        • 原理
          • 通过两步测定对药物准确定量，消除了酸性杂质和酯键水解的干扰，大大提高了方法的准确性
        • 适用范围
          • 阿司匹林片剂
          • 原因
            • 消除片剂中稳定剂干扰（枸橼酸或酒石酸）
            • 消除水解产物干扰：片剂在贮存过程中水解产生水杨酸和醋酸
        • 测定
          • 第一步：中和
            • 操作
              • 精密称取片粉一定量，加中性乙醇溶解后，以酚酞为指示剂，用NaOH滴定液迅速滴定至粉红色
              • 不需要进行NaOH滴定液的准确计量
              • 要求迅速是为了防止阿司匹林酯键水解
            • 目的
              • 排除酸性稳定剂和水解产生的水杨酸及醋酸的干扰
              • 药物中水杨酸及阿司匹林均成为相应的钠盐
          • 第二步：水解后剩余滴定
            • 在中和后的供试品溶液中，定量过量地加入NaOH，加热水解反应完全并放冷后，以硫酸滴定剩余的氢氧化钠
        • 含量计算
      • 紫外-可见分光光度法
        • 直接紫外-可见分光光度法
        • 柱分配-紫外分光光度法
          • 适用
            • 片剂、胶囊、栓剂
          • 特点
            • 能分离杂质，同时测定水杨酸和阿司匹林，较为准确
          • 固定相
            • 碳酸氢钠
          • 洗脱液
            • 冰醋酸-氯仿
          • 测定方法
            • λmax=280nm测定吸光度，计算含量
          • 装置及方法
            • 固定相将阿司匹林和水杨酸保留在层析柱上，通过三氯甲烷淋洗去除中性杂质，将三氯甲烷用冰醋酸酸化后洗脱阿司匹林和水杨酸
            • 收集洗脱液，以紫外分光光度法来计算水杨酸和阿司匹林含量
      • 高效液相色谱法
        • 对制剂含量测定，多采用专属性更强的高效液相色谱法
        • 《中国药典》2015版收载的典型芳酸类非甾体抗炎药物制剂大多采用离子抑制-反相HPLC法测定，外标法计算含量
        • 《中国药典》2015版采用HPLC法测定阿司匹林制剂含量
          • 色谱条件
            • C18柱，以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水（20:5:5:70）为流动相，检测波长276nm
          • 系统适用性试验
            • 理论塔板数按阿司匹林峰计算不低于3000，阿司匹林与水杨酸的分离度符合要求