王镜岩 生物化学 上册 6 、酶的催化作用

王镜岩 生物化学 上册 第六章 酶的催化作用，包括酶是生物催化剂 、酶的化学本质及其组成 、酶的命名和分类 、六大类酶催化反应的性质、酶的专一性 、酶的活力测定 、酶的分离纯化 、核酶 、抗体酶(abzyme)、酶工程等内容。

第 六 章 酶 的 催 化 作 用

• 一、酶是生物催化剂
• （一）酶的概念
  • ★ 酶(Enzyme)：活细胞产生的一类对其底物具有高效催化性和高度特异性的Pro(或核酸),称为生物催化剂(biocatalyst)。
  •  ● 底物 (substrate)：在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物。
  • 🌸 活化能 (activation energy)：在一定温度下，使1mol 底物全部进入活化状态所需的自由能，称活化能。
• （ 二）酶催化作用的特点
  • 1、酶与一般催化剂的共同特点
  • ① 能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡常数。
  • ② 酶本身在反应前后的化学本质和数量保持不变。
  • ③ 酶能够稳定底物形成过渡状态，降低反应的活化能，从而加速反应的进行。
  • 2、酶作为生物催化剂的特性
  • （1）酶易失活
    • ● 由于大多数酶是Pro，凡能使Pro变性的因素如强酸、强碱高温等条件都能使酶破坏而完全失去活性。
    • 酶催化反应往往在较温和的常温、常压和接近中性pH条件下进行。
  • （2）高的催化效率
    • ● 酶的催化效率比化学催化剂高10^7~10^13倍，比非催化反应高10^8~10^20倍。
    • ★ 转换数(turnover number, TN or kcat)：一定条件下， 每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。【其大小可以反映酶的催化效率】
  • （3）高度专一性
    • ● 酶的专一性/特异性：是指酶在催化生化反应时对底物的严格选择性，即一种酶只能催化一种或一类反应， 作用于一种或一类物质。这种选择性是通过酶与反应物间的相互作用或通过基于结构互补的分子识别实现的。
    • ❗️ 酶的专一性可分为结构专一性、立体异构专一性。
  • （4）酶活性 受到调节和控制
    • ① 调节酶的浓度
      • a. 诱导或抑制酶的合成
      • b. 调节酶的降解
        • · 如：乳糖操纵子的lac Z、Y、A基因分别编码三种酶：β -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷透性酶、β -半乳糖苷乙酰基转移酶，它们受 乳糖 / IPTG 诱导合成。乳糖 / IPTG可与系统中的阻遏物结合，降低阻遏物与DNA的结合，解除抑制，使得RNA pol可结合与启动子上，启动后续三种基因的转录，三种酶的合成加快，酶浓度提高。
        • · 大肠杆菌还存在葡萄糖效应，在葡萄糖存在情况下不利用乳糖 → 葡萄糖抑制了以上三种酶的合成。
    • ② 激素调节酶的活性
      • ● 激素通过与细胞膜 / 细胞膜内受体结合而引起一系列生物学效应，以此来调节酶活性。
      • · 如乳腺组织中合成乳糖由乳糖合成酶催化，该酶由催化亚基和调节亚基组成。催化亚基单独存在时不能催化合成乳糖，调节亚基实际上是 α-乳清蛋白，本身无催化活性，但与催化亚基结合后，可改变催化亚基的专一性，催化产生乳糖。 ⭐️ 调节亚基的合成受激素控制：当分娩后，激素急剧增加 → 调节亚基大量合，并与催化亚基结合结合成乳糖合成酶 → 合成大量乳糖。
    • ③ 反馈抑制调节酶的活性
      • ● 许多小分子物质的合成是由一连串反应组成的，催化物质生成的第一步酶，往往被它们的终端产物所抑制，这种抑制称为反馈抑制。
      • · 如Thr合成Ile的应。
    • ④ 抑制剂和激活剂对酶活性的调节
      • a. 酶受大分子抑制剂 / 小分子物质抑制，从而影响酶的活性； b. 此外，某些无机离子可对一些酶产生抑制，对另一些酶产生激活，从而对酶活性起调节作用。
    • ⑤ 其它调节方式：共价修饰调节、别构调节酶原激活、同功酶等。
• 二、酶的化学本质及其组成
• （一）酶的化学本质
  • ⭐️ 除了核酶外，几乎所有的酶都是蛋白质。
  • · 原因：① 水解产物是氨基酸； ② 能被蛋白质变性剂所失活； ③ 两性电解质； ④ 不能透过半透膜； ⑤ 具备蛋白质所有的化学颜色反应。
  • ⚠️ 酶催化的活性依赖于它们天然Pro构象的完整性。
• （二）酶的化学组成
  • ★ 辅酶 / 辅基：在催化中起着电子、原子或某些化学基团的传递作用。 ★ 脱辅酶：决定酶催化的专一性。
• （三）单体酶、 寡聚酶、 多酶复合物
  • ● 单体酶：仅有一个活性中心的多肽链构成的酶，一般是由一条多肽链组成，如牛胰核糖核酸酶、溶菌酶等。但有的单体酶由多条肽链组成，如：胰凝乳蛋白酶由3条链组成，链间由二硫键相连构成一个共价整体。这类含几条肽链的单体酶往往是由一条前体肽链经活化断裂而成。
  • ·单体酶种类少，一般是催化水解反应的酶。
  • ● 聚合酶：由2个或多个相同或不同亚基组成的酶，称为寡聚酶。绝大多数寡聚酶都含有偶数亚基，但个别寡聚酶含基数亚基，单独的亚基一般无活性，必需相互结合才有活性。其活性可受各种形式的灵活调节，对代谢过程起重要的调控作用。
  • ● 多酶复合体：由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成。连续反应体系中前一反应的产物为后一反应的底物，反应依次连接，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。
  • · 多功能酶（串联酶 ）：一条多肽链具有多种催化功能。
• 三、酶的命名和分类
• （一）习惯命名法
• （二）国际系统命名法
  • (1)标明底物，催化反应的性质。 例:G-6-P→F-6-P G-6-P异构酶
  • (2)两个底物参加反应时应同时列出，中间用冒号(:)分开。如其中一个底物为水时， 水可略去。
  • · 例1:丙氨酸+α-酮戊二酸 → 谷氨酸+丙酮酸 丙氨酸:α-酮戊二酸氨基转移酶 · 例2:脂肪+H2O → 脂酸+甘油 脂肪水解酶
• （三）国际系统分类法及酶的编号
  • 🛎编号前冠以EC，第一个数字 → 该酶属于六大类中的哪一类；第二个数字 → 属于哪个亚类； 第三个数字 → 在哪个亚亚类； 第四个数字 → 在亚亚类中的排号；
  • 国际生物化学会酶学委员会将酶分为6类： 1. 氧化还原酶类 2. 转移酶 3. 水解酶类4. 裂合酶类 5. 异构酶类 6. 连接酶类(合成酶类)
• 四、六大类酶催化反应的性质 【氧转水裂异连接】
• （一）氧化还原酶类
  • ● (1)氧化酶类:催化底物脱氢并氧化,生成H2O或H2O2.
  • ● (2)脱氢酶类:直接催化底物脱氢
  • · 包括脱氢酶、氧化酶、还原酶、过氧化物酶等；需要辅酶I和辅酶II作为氢受体或供体。
• （二）转移酶类
  • ● 催化化合物某些基团的转移，即一分子上的某一基团转移到另一分子上的反应。
  • · 甲基转移酶、氨基转移酶、转氨酶……
• （三）水解酶类
  • ● 催化底物的水解
  • `淀粉酶、蛋白酶等。水解酶多位胞外酶。
• （四）裂解酶类
  • ● 催化从底物中移去一个基团而形成双键的反应或其你反应。
  • · 醛缩酶、脱水酶等
• （五）异构酶类
  • ● 催化各种同分异构体之间的相互转变，即分子内部基团的重新排列。
  • · 消旋酶等
• （六）连接酶类
  • ● 将两个小分子合成一个大分子，通常需要ATP供能。
• 五、酶的专一性
• （一）酶对底物的专一性
  • 1.结构专一性
    • 绝对专一性
      • · 只作用于特定结构的底物，进行特定反应，生成特定产物。
    • 相对专一性
      • · 作用于相同化学键或化学基团的一类化合物。
      • 键专一性：有些酶只作用于底物一定的键。
  • · 概念 : 酶对所催化的分子—底物化学结构的特殊要求和选择。
  • 2.立体异构专一性
    • 旋光异构专一性
    • 几何异构专一性
  • ·概念 : 酶除了对底物分子的化学结构有要求外对其立体异构也有一定的要求。
• （二）关于酶作用专一性的假说
  • ★★★ ① 诱导契合假说：酶活性中心的结构并非和底物的结构相吻合，是具有高柔性的动态构象分子，当酶与底物接近时，酶蛋白受到诱导 → 其构象发生有利于底物结合的变化，有关的各基团达到正确的排列和定向，使酶和底物契合成 → 中间络合物 → 底物发生反应 → 反应结束后产物从酶分子上脱落下来 → 酶活性中心恢复原本构象。
  • ② 锁钥学说：酶于底物即锁与钥匙的关系。 局限：不能解释酶的逆反应。
• 六、酶的活力测定
• （一）酶活力 (enzyme activity)
  • ● 酶活力也称酶活性，指酶催化一定化学反应的能力。其大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速率来表示。（两者呈线型关系，酶催化反应速率 ↑，酶活力 ↑）
  • ✨酶活力测定实际上就是酶的定量测定。
  • ✨酶促反应速率：用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。（一般以测定产物增加量为准）【曲线斜率代表反应速率】
  • 随反应时间的延长，酶反应速度会降低。原因：
    • 1)底物浓度的降低;
    • 2)酶的部分失活;
    • 3)产物对酶的抑制;
  • 所以:研究酶反应速度以酶促反应的初速度为准。（反应初速度与酶量呈线性关系）
• （二）酶的活力单位 即酶单位（U）
  • · 酶活力的大小即酶含量的多少。
  • ★ 酶单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。这样酶的含量就可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示(单位是U/g或U/ml)。
  • ● 酶活力的国际单位
    • ① IU：在最适反应条件下(25°C），每分钟内转化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。1 IU=1 mmol/min。
    • ② Kat单位：在最适条件下，每秒钟能催化 1mol底物转化为产物所需的酶量，定为1Kat=1mol/s。
    • 1Kat = 60×10^6 IU
• (三) 酶的比活力
  • ★ 酶的比活力代表酶的纯度，即每mg酶蛋白所具有的酶活力单位数。同种酶来说，比活力 ↑，纯度 ↑。
• （四）酶活力的测定方法
  • （1）分光光度法
    • 该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。
  • （2）荧光法
    • 主要利用底物或产物的荧光性质。灵敏度高，但易受到干扰。
  • （3）同位素测定法
    • 同位素标记底物，反应后经分离，检测产物的脉冲数，即可换 算成酶的活力单位。灵敏度最高。
  • （4）电化学方法
    • pH计、 氧电极法。
• 七、酶的分离纯化
• 指标：
  • 1、总活力的回收
    • → 提纯过程中酶的损失情况
  • 2、比活力提高的倍数
    • → 提纯方法的有效程度
  • ❄️ 在酶的制备过程中，每一步都要测定酶的活力饿比活力，以了解酶的回收率及提纯倍数，以便判断提纯效果。
• 生物细胞中产生酶的有两类：
  • 胞外酶
    • →多为水解酶。
  • 胞内酶
• 提取和保存酶应注意：
  • 1、选材 → 常用微生物作原材料，要选酶丰富的组织器官。
  • 2、破碎
  • 3、低温抽提
  • 4、分离与纯化要在0-5 º操作，在搅拌容易起泡的阶段，要避免酶蛋白在aq表面变性，并加入螯合剂，抑制金属酶。
  • 5、纯化结晶
  • 6、保存：冻干或浓溶液保存。
• 八、核酶
• （一）核酶：具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特异的mRNA序列。
• （二）核酶的种类
  • 根据分子大小分：
    • 大分子核酶：I型内含子、II型内含子、RNase P的RNA组分。
    • 小分子核酶：锤头型、发夹型、肝炎δ病毒、Vs核酶。
• （三）核酶的研究意义及应用前景
  • 1、意义
    • ① RNA具有酶的催化活性，向酶的化学本质是蛋白质这一传统概念提出了挑战。
    • ② 在理论上，对于生物起源和生命进化的研究具有重要启示。
    • ③ 在实践上，由于核酶的内切酶活性，可定点切割及破坏mRNA，抑制基因表达，为基因、病毒和肿瘤治疗提供了可行途径。
  • 2、前景
    • ① 设计新的核酶：根据已有核酶的特点设计自然界没有的核酶。
    • ② 用核酶进行基因治疗：利用核酶能力引入新的基因功能或修复已有的缺陷基因。
    • ③ 阻断基因表达，用作抗病毒感染、抗肿瘤的有效药物。
• 九、抗体酶(abzyme)：指具有催化活性的免疫球蛋白，即在其高可变区赋予了酶的属性。是抗体的高度选择性与 酶的高效催化性相结合的产物，是蛋白质分子设计的一种 新方法。
• （一）可通过两种途径获得抗体酶
  • ① 采用过渡态的底物类似物诱导；
  • ② 在现有抗体的基础上通过化学修饰/通过Pro工程向其配体结合部位引入催化基团；
• （二）抗体酶的意义
  • 1.为蛋白质结构的研究提供新手段；
  • 2.设计新型生物药物；
  • 3.应用于工业制药(立体专一性抗体酶)；
• ⭐️ 半抗原：具有免疫原性而无反应活性。
• 十、酶工程：主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。
• 分类
  • 化学酶工程 / 初级酶工程
  • ★ 生物酶工程 / 高级酶工程
• （一）化学酶工程
  • ● 定义：指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。
  • 1、天然酶
    • 工业用酶制剂多属于通过微生物发酵而获得的粗酶。
  • 2、化学修饰酶 【可对酶分子表 面/内部修饰】
    • （1）化学修饰酶的功能基
    • （2）交联反应
    • （3）大分子修饰作用
  • 3、固定化酶：酶固定化的方法大致为物理法（吸附法、包埋法）和化学法（共价偶联法、交联法）。
  • 4、模拟酶：在深入了解酶的结构和功能以及催化作用机制的基础上，用有机化学半合成法/全合成法合成的比天然酶简单的非Pro分子，又称为人工酶催化剂。【如：固氮酶】
• （二）生物酶工程
  • ● 定义：生物酶工程以酶学和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，也称为高级酶工程。主要包括三方面的内容：① 克隆酶：用基因工程技术大量生产酶。② 突变酶：对酶基因进行修饰，产生遗传重组的修饰酶。 ③ 设计酶：合成自然界不曾有的新酶。

第 六 章 酶 的 催 化 作 用

• 一、酶是生物催化剂
• （一）酶的概念
  • ★ 酶(Enzyme)：活细胞产生的一类对其底物具有高效催化性和高度特异性的Pro(或核酸),称为生物催化剂(biocatalyst)。
  •  ● 底物 (substrate)：在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物。
  • 🌸 活化能 (activation energy)：在一定温度下，使1mol 底物全部进入活化状态所需的自由能，称活化能。
• （ 二）酶催化作用的特点
  • 1、酶与一般催化剂的共同特点
  • ① 能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡常数。
  • ② 酶本身在反应前后的化学本质和数量保持不变。
  • ③ 酶能够稳定底物形成过渡状态，降低反应的活化能，从而加速反应的进行。
  • 2、酶作为生物催化剂的特性
  • （1）酶易失活
    • ● 由于大多数酶是Pro，凡能使Pro变性的因素如强酸、强碱高温等条件都能使酶破坏而完全失去活性。
    • 酶催化反应往往在较温和的常温、常压和接近中性pH条件下进行。
  • （2）高的催化效率
    • ● 酶的催化效率比化学催化剂高10^7~10^13倍，比非催化反应高10^8~10^20倍。
    • ★ 转换数(turnover number, TN or kcat)：一定条件下， 每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。【其大小可以反映酶的催化效率】
  • （3）高度专一性
    • ● 酶的专一性/特异性：是指酶在催化生化反应时对底物的严格选择性，即一种酶只能催化一种或一类反应， 作用于一种或一类物质。这种选择性是通过酶与反应物间的相互作用或通过基于结构互补的分子识别实现的。
    • ❗️ 酶的专一性可分为结构专一性、立体异构专一性。
  • （4）酶活性 受到调节和控制
    • ① 调节酶的浓度
      • a. 诱导或抑制酶的合成
      • b. 调节酶的降解
        • · 如：乳糖操纵子的lac Z、Y、A基因分别编码三种酶：β -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷透性酶、β -半乳糖苷乙酰基转移酶，它们受 乳糖 / IPTG 诱导合成。乳糖 / IPTG可与系统中的阻遏物结合，降低阻遏物与DNA的结合，解除抑制，使得RNA pol可结合与启动子上，启动后续三种基因的转录，三种酶的合成加快，酶浓度提高。
        • · 大肠杆菌还存在葡萄糖效应，在葡萄糖存在情况下不利用乳糖 → 葡萄糖抑制了以上三种酶的合成。
    • ② 激素调节酶的活性
      • ● 激素通过与细胞膜 / 细胞膜内受体结合而引起一系列生物学效应，以此来调节酶活性。
      • · 如乳腺组织中合成乳糖由乳糖合成酶催化，该酶由催化亚基和调节亚基组成。催化亚基单独存在时不能催化合成乳糖，调节亚基实际上是 α-乳清蛋白，本身无催化活性，但与催化亚基结合后，可改变催化亚基的专一性，催化产生乳糖。 ⭐️ 调节亚基的合成受激素控制：当分娩后，激素急剧增加 → 调节亚基大量合，并与催化亚基结合结合成乳糖合成酶 → 合成大量乳糖。
    • ③ 反馈抑制调节酶的活性
      • ● 许多小分子物质的合成是由一连串反应组成的，催化物质生成的第一步酶，往往被它们的终端产物所抑制，这种抑制称为反馈抑制。
      • · 如Thr合成Ile的应。
    • ④ 抑制剂和激活剂对酶活性的调节
      • a. 酶受大分子抑制剂 / 小分子物质抑制，从而影响酶的活性； b. 此外，某些无机离子可对一些酶产生抑制，对另一些酶产生激活，从而对酶活性起调节作用。
    • ⑤ 其它调节方式：共价修饰调节、别构调节酶原激活、同功酶等。
• 二、酶的化学本质及其组成
• （一）酶的化学本质
  • ⭐️ 除了核酶外，几乎所有的酶都是蛋白质。
  • · 原因：① 水解产物是氨基酸； ② 能被蛋白质变性剂所失活； ③ 两性电解质； ④ 不能透过半透膜； ⑤ 具备蛋白质所有的化学颜色反应。
  • ⚠️ 酶催化的活性依赖于它们天然Pro构象的完整性。

第 六 章 酶 的 催 化 作 用

• （二）酶的化学组成
  • ★ 辅酶 / 辅基：在催化中起着电子、原子或某些化学基团的传递作用。 ★ 脱辅酶：决定酶催化的专一性。
• （三）单体酶、 寡聚酶、 多酶复合物
  • ● 单体酶：仅有一个活性中心的多肽链构成的酶，一般是由一条多肽链组成，如牛胰核糖核酸酶、溶菌酶等。但有的单体酶由多条肽链组成，如：胰凝乳蛋白酶由3条链组成，链间由二硫键相连构成一个共价整体。这类含几条肽链的单体酶往往是由一条前体肽链经活化断裂而成。
  • ·单体酶种类少，一般是催化水解反应的酶。
  • ● 聚合酶：由2个或多个相同或不同亚基组成的酶，称为寡聚酶。绝大多数寡聚酶都含有偶数亚基，但个别寡聚酶含基数亚基，单独的亚基一般无活性，必需相互结合才有活性。其活性可受各种形式的灵活调节，对代谢过程起重要的调控作用。
  • ● 多酶复合体：由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成。连续反应体系中前一反应的产物为后一反应的底物，反应依次连接，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。
  • · 多功能酶（串联酶 ）：一条多肽链具有多种催化功能。
• 三、酶的命名和分类
• （一）习惯命名法
• （二）国际系统命名法
  • (1)标明底物，催化反应的性质。 例:G-6-P→F-6-P G-6-P异构酶
  • (2)两个底物参加反应时应同时列出，中间用冒号(:)分开。如其中一个底物为水时， 水可略去。
  • · 例1:丙氨酸+α-酮戊二酸 → 谷氨酸+丙酮酸 丙氨酸:α-酮戊二酸氨基转移酶 · 例2:脂肪+H2O → 脂酸+甘油 脂肪水解酶
• （三）国际系统分类法及酶的编号
  • 🛎编号前冠以EC，第一个数字 → 该酶属于六大类中的哪一类；第二个数字 → 属于哪个亚类； 第三个数字 → 在哪个亚亚类； 第四个数字 → 在亚亚类中的排号；
  • 国际生物化学会酶学委员会将酶分为6类： 1. 氧化还原酶类 2. 转移酶 3. 水解酶类4. 裂合酶类 5. 异构酶类 6. 连接酶类(合成酶类)
• 四、六大类酶催化反应的性质 【氧转水裂异连接】
• （一）氧化还原酶类
  • ● (1)氧化酶类:催化底物脱氢并氧化,生成H2O或H2O2.
  • ● (2)脱氢酶类:直接催化底物脱氢
  • · 包括脱氢酶、氧化酶、还原酶、过氧化物酶等；需要辅酶I和辅酶II作为氢受体或供体。
• （二）转移酶类
  • ● 催化化合物某些基团的转移，即一分子上的某一基团转移到另一分子上的反应。
  • · 甲基转移酶、氨基转移酶、转氨酶……
• （三）水解酶类
  • ● 催化底物的水解
  • `淀粉酶、蛋白酶等。水解酶多位胞外酶。
• （四）裂解酶类
  • ● 催化从底物中移去一个基团而形成双键的反应或其你反应。
  • · 醛缩酶、脱水酶等
• （五）异构酶类
  • ● 催化各种同分异构体之间的相互转变，即分子内部基团的重新排列。
  • · 消旋酶等
• （六）连接酶类
  • ● 将两个小分子合成一个大分子，通常需要ATP供能。

第 六 章 酶 的 催 化 作 用

• 五、酶的专一性
• （一）酶对底物的专一性
  • 1.结构专一性
    • 绝对专一性
      • · 只作用于特定结构的底物，进行特定反应，生成特定产物。
    • 相对专一性
      • · 作用于相同化学键或化学基团的一类化合物。
      • 键专一性：有些酶只作用于底物一定的键。
  • · 概念 : 酶对所催化的分子—底物化学结构的特殊要求和选择。
  • 2.立体异构专一性
    • 旋光异构专一性
    • 几何异构专一性
  • ·概念 : 酶除了对底物分子的化学结构有要求外对其立体异构也有一定的要求。
• （二）关于酶作用专一性的假说
  • ★★★ ① 诱导契合假说：酶活性中心的结构并非和底物的结构相吻合，是具有高柔性的动态构象分子，当酶与底物接近时，酶蛋白受到诱导 → 其构象发生有利于底物结合的变化，有关的各基团达到正确的排列和定向，使酶和底物契合成 → 中间络合物 → 底物发生反应 → 反应结束后产物从酶分子上脱落下来 → 酶活性中心恢复原本构象。
  • ② 锁钥学说：酶于底物即锁与钥匙的关系。 局限：不能解释酶的逆反应。
• 六、酶的活力测定
• （一）酶活力 (enzyme activity)
  • ● 酶活力也称酶活性，指酶催化一定化学反应的能力。其大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速率来表示。（两者呈线型关系，酶催化反应速率 ↑，酶活力 ↑）
  • ✨酶活力测定实际上就是酶的定量测定。
  • ✨酶促反应速率：用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。（一般以测定产物增加量为准）【曲线斜率代表反应速率】
  • 随反应时间的延长，酶反应速度会降低。原因：
    • 1)底物浓度的降低;
    • 2)酶的部分失活;
    • 3)产物对酶的抑制;
  • 所以:研究酶反应速度以酶促反应的初速度为准。（反应初速度与酶量呈线性关系）
• （二）酶的活力单位 即酶单位（U）
  • · 酶活力的大小即酶含量的多少。
  • ★ 酶单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。这样酶的含量就可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示(单位是U/g或U/ml)。
  • ● 酶活力的国际单位
    • ① IU：在最适反应条件下(25°C），每分钟内转化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。1 IU=1 mmol/min。
    • ② Kat单位：在最适条件下，每秒钟能催化 1mol底物转化为产物所需的酶量，定为1Kat=1mol/s。
    • 1Kat = 60×10^6 IU
• (三) 酶的比活力
  • ★ 酶的比活力代表酶的纯度，即每mg酶蛋白所具有的酶活力单位数。同种酶来说，比活力 ↑，纯度 ↑。
• （四）酶活力的测定方法
  • （1）分光光度法
    • 该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。
  • （2）荧光法
    • 主要利用底物或产物的荧光性质。灵敏度高，但易受到干扰。
  • （3）同位素测定法
    • 同位素标记底物，反应后经分离，检测产物的脉冲数，即可换 算成酶的活力单位。灵敏度最高。
  • （4）电化学方法
    • pH计、 氧电极法。
• 七、酶的分离纯化
• 指标：
  • 1、总活力的回收
    • → 提纯过程中酶的损失情况
  • 2、比活力提高的倍数
    • → 提纯方法的有效程度
  • ❄️ 在酶的制备过程中，每一步都要测定酶的活力饿比活力，以了解酶的回收率及提纯倍数，以便判断提纯效果。

第 六 章 酶 的 催 化 作 用

• 生物细胞中产生酶的有两类：
  • 胞外酶
    • →多为水解酶。
  • 胞内酶
• 提取和保存酶应注意：
  • 1、选材 → 常用微生物作原材料，要选酶丰富的组织器官。
  • 2、破碎
  • 3、低温抽提
  • 4、分离与纯化要在0-5 º操作，在搅拌容易起泡的阶段，要避免酶蛋白在aq表面变性，并加入螯合剂，抑制金属酶。
  • 5、纯化结晶
  • 6、保存：冻干或浓溶液保存。
• 八、核酶
• （一）核酶：具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特异的mRNA序列。
• （二）核酶的种类
  • 根据分子大小分：
    • 大分子核酶：I型内含子、II型内含子、RNase P的RNA组分。
    • 小分子核酶：锤头型、发夹型、肝炎δ病毒、Vs核酶。
• （三）核酶的研究意义及应用前景
  • 1、意义
    • ① RNA具有酶的催化活性，向酶的化学本质是蛋白质这一传统概念提出了挑战。
    • ② 在理论上，对于生物起源和生命进化的研究具有重要启示。
    • ③ 在实践上，由于核酶的内切酶活性，可定点切割及破坏mRNA，抑制基因表达，为基因、病毒和肿瘤治疗提供了可行途径。
  • 2、前景
    • ① 设计新的核酶：根据已有核酶的特点设计自然界没有的核酶。
    • ② 用核酶进行基因治疗：利用核酶能力引入新的基因功能或修复已有的缺陷基因。
    • ③ 阻断基因表达，用作抗病毒感染、抗肿瘤的有效药物。
• 九、抗体酶(abzyme)：指具有催化活性的免疫球蛋白，即在其高可变区赋予了酶的属性。是抗体的高度选择性与 酶的高效催化性相结合的产物，是蛋白质分子设计的一种 新方法。
• （一）可通过两种途径获得抗体酶
  • ① 采用过渡态的底物类似物诱导；
  • ② 在现有抗体的基础上通过化学修饰/通过Pro工程向其配体结合部位引入催化基团；
• （二）抗体酶的意义
  • 1.为蛋白质结构的研究提供新手段；
  • 2.设计新型生物药物；
  • 3.应用于工业制药(立体专一性抗体酶)；
• ⭐️ 半抗原：具有免疫原性而无反应活性。
• 十、酶工程：主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。
• 分类
  • 化学酶工程 / 初级酶工程
  • ★ 生物酶工程 / 高级酶工程
• （一）化学酶工程
  • ● 定义：指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。
  • 1、天然酶
    • 工业用酶制剂多属于通过微生物发酵而获得的粗酶。
  • 2、化学修饰酶 【可对酶分子表 面/内部修饰】
    • （1）化学修饰酶的功能基
    • （2）交联反应
    • （3）大分子修饰作用
  • 3、固定化酶：酶固定化的方法大致为物理法（吸附法、包埋法）和化学法（共价偶联法、交联法）。
  • 4、模拟酶：在深入了解酶的结构和功能以及催化作用机制的基础上，用有机化学半合成法/全合成法合成的比天然酶简单的非Pro分子，又称为人工酶催化剂。【如：固氮酶】
• （二）生物酶工程
  • ● 定义：生物酶工程以酶学和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，也称为高级酶工程。主要包括三方面的内容：① 克隆酶：用基因工程技术大量生产酶。② 突变酶：对酶基因进行修饰，产生遗传重组的修饰酶。 ③ 设计酶：合成自然界不曾有的新酶。