核酸含量紫外线测定实验

这是一篇关于核酸含量紫外线测定实验，详细介绍了核酸含量紫外线测定实验，实验原理等等及注意事项及思考题

测定核酸含量

• 实验目的
  • 学习和掌握应用紫外分光光度法 测定核酸含量的原理及技术。
  • 熟悉紫外分光光度计的基本原理及正确使用方法。
• 实验原理
  • RNA和DNA都有吸收紫外光的质，它们的吸收高峰在260nm波长处。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的。每毫升溶液含1微克RNA的光密度值相当于0.024，每毫升溶液含1微克DNA钠盐的光密度值为0.020。故测定未知RNA或DNA溶液260nm处的吸收值即可计算出其中的核酸的含量。此法简便，迅速。蛋白质也吸收紫外光，通常蛋白质的吸收高峰280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，若样品中混有 大量的蛋白质或其它吸收物质，应设法除去。
• 实验器材及试剂
  • 试剂
    • ( 1)钼酸铵-过氯酸沉淀剂( 0.25%钼酸铵-2.5%过氯酸溶液) :取3.6毫升70%过氯酸和0.25克钼酸铵溶于96.4毫升蒸馏中。 (2)样品RNA或DNA。
  • 器材
    • ( 1)容量瓶(25毫升)。 ( 2)离心管。 ( 3)离心机。 ( 4)紫外分光光度计。
• 实验操作
  • 将核酸样品配制成每毫升含5 ~ 50微克核酸的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm吸收值，计算核酸浓度。 RNA( DNA)浓度(μ g/mL)=[OD260/0.024(0.020)L]*N 式中: OD260为 260nm 波长处光密度读数; L为比色杯的厚度; 0.024 为每毫升溶液内含1微克RNA的光密度; 0.020 为每毫升溶液内含1微克DNA钠盐时的光密度。如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则在测定时需加钼酸铵过氯酸沉淀剂， 沉淀除去大分子核酸，测定上清液处吸收值作为对照。
  • 具体操作如下:分别取0.5 ml RNA样品液，分别加入到甲、乙两支离心管中，甲中加入0.5ml蒸馏水，乙中加0.5ml沉淀剂，混匀，冰浴中放置30 min，于4000rpm下离心10 min分别吸取上清液0.25ml用蒸馏水定容至25 ml，选择厚度 1cm石英比色皿测出OD260。 RNA( DNA)浓度(μ g/mL)=[△OD260/0.024(0.020)L]*N式中:△OD260为甲管稀释液在260nm波长处吸收值减去乙管稀释液在260nm波 长处吸收值。（甲SA-1，乙SB-1)
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• 实验结果
  • SA-1数据错误，数据无法计算
    • 分析：最主要第一组数据错误可能是比色皿清洗时水未吸干，导致了稀释，数据偏低。仪器读数未稳定就记录。
• 思考题
  • 钼酸铵-过氯酸：沉淀了什么 沉淀除去大分子核酸
  • 若样品中含有蛋白质/DNA污染，如何排除干扰？ 因为两者的最大吸光值不一样，核酸的在260nm,而蛋白质的在280nm ，所以两者之间存在着一个比值关系，一般而言，纯蛋白质的OD280/OD260约为1.8，而纯核酸的比值大约为0.5.
  • 适用浓度范围 由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些 小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响， 要求核酸吸光值 至少大于 0.1A ，吸光值最好在 0.1-1.5 A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。 从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。