蛋白质和氨基酸理化性质测定实验

这是一篇关于蛋白质和氨基酸理化性质测定实验的思维导图，包括五个呈色反应，沉淀反应及两性反应的实验报告

蛋白质和氨基酸的理化性质

• 沉淀反应（比较可逆与不可逆）
  • 实验原理
    • 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
    • 蛋白质的沉淀反应可分为两种类型： (1)可逆的沉淀的反应：蛋白质分子的结构尚未发 (2)不可逆沉淀反应：蛋白质分子内部结构发生重大改变
      • 注：变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
  • 实验试剂
    • （1）蛋白质溶液； （2）蛋白质氯化钠溶液（3）硫酸铵粉末 (4)0.5%乙酸铅溶液； (5)浓硫酸； (6)1%硫酸铜溶液 （7）10%乙酸溶液；（8）10%三氯乙酸溶液（9）饱和硫酸铵溶液 （10）95%乙醇； （11）浓硝酸； （12）饱和氯化钠溶液 （13）5%硝酸银溶液；（14）浓盐酸； （15）0.5%磺基水杨酸溶液 （16）0.1%乙酸溶液；（17）10%氢氧化钠溶液； （18）5%鞣酸； （20）1%乙酸溶液
  • 实验操作
    • 蛋白质盐析：加蛋白质氯化钠溶液2ml于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置5分钟。如果有沉淀，加少量水，观察是否溶解。 将管中内容物过滤，后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌.直至粉末不再溶解为止，如果产生沉淀，取出部分，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。 重金属离子沉淀蛋白质：取2支试管，各加入蛋白质溶液0.5 ml再分别加5%硝酸银溶液和1%硫酸铜溶液1-2滴，振荡试管，观察是否有沉淀产生。如果有，放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，观察沉淀是否溶解？ 某些有机酸沉淀蛋白质：取2支试管加入蛋白质溶液 0.5 ml 再加10% 三氯乙酸溶液，观察沉淀是否生成 无机酸沉淀蛋白质：取2支试管，分别加入浓盐酸、浓硫酸各 15滴。小心地向2支试管中 沿管壁加人蛋白质溶液6滴、不要摇动，观察各管内两液面处有是否白色环状蛋白质沉淀出现。然后，摇动每个试管，观察蛋白质沉淀是否溶解。 生物碱试剂沉淀蛋白质：取试管1支，各加入0.5 ml蛋白质溶液及1%乙酸溶液2—3 滴。向一管中加入5%鞣酸溶液数滴，观察结果，如果产生沉淀，加水，看是否溶解。
    • 加热沉淀蛋白质
      • 加热沉淀蛋白质取6支试管，编号，按下表加入有关试剂 (单位：滴) 加毕，将各管混匀 观察、记录各管现象后，然后放入100℃恒温水浴中保温 或沸水浴中 10min，注意观察、比较管的沉淀情况。然后，将第3 ，4，5号管分别用10% NaOH溶液或10%乙酸溶液中和，观察并解释实验结果。
  • 实验现象及结果
    • 蛋白质盐析：加入溶液时产生的沉淀是白色絮状物，加水后溶解： 之后加入粉末，此时析出的沉淀为清蛋白，加水后依旧溶解。(脱水沉淀）
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    • 重金属离子沉淀蛋白质：都有沉淀产生，硝酸银产生乳白色沉淀，硫酸铜产生浅蓝色沉淀，加水后都不可以溶解。(溶液pH小于蛋白质等电点，蛋白质颗粒带正电，失去电荷沉淀，和重金属离子形成不溶性盐)
    • 某些有机酸沉淀蛋白质：产生乳白色沉淀，加水后不可以溶解（溶液pH小于蛋白质等电点，蛋白质颗粒带正电，生成不溶性盐）
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    • 无机酸沉淀蛋白质：液面处都有白色环状沉淀产生，摇动后溶解消失。（脱水沉淀）
    • 生物碱试剂沉淀蛋白质：上层产生乳白色沉淀，下层是鞣酸本来的橙色。加水后不可以溶解。(不溶解是因为溶液pH小于蛋白质等电点，蛋白质颗粒带正电，容易与鞭酸根负离子发生反应，生成不溶性的盐而沉淀)
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    • 加热沉淀蛋白质
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• 两性反应（等电点测定）
  • 实验原理
    • 蛋白质分子除含有一定的自由氨基和羧基外，还含有酚基、巯基、胍基、咪唑基等，因此，蛋白质和氨基酸一样也有两性电离的性质。 在溶液中，蛋白质的解离状态受溶液酸碱度影响酸性溶液中蛋白质解离成阳离子，碱性溶液中则解离成阴离子。 等电点时，蛋白质分子所携带的正负电荷相等，以兼性离子存在，在电场中不向正负电极移动，在溶液中溶解度最小，容易沉淀析出。 不同的蛋白质等电点不同，可利用溶解度来测定其等电点。向各种不同pH值的缓冲溶液中加入酪蛋白，以沉淀出现最多的缓冲液的pH值为酪蛋白的等电点。
  • 实验试剂
    • (1) 0.5%酪蛋白溶液 （2）酪蛋白乙酸钠溶液 (3)0.01%澳甲酚绿指示剂 （4）0.02 mol/L 盐酸溶液 （5）0.10 mol/L 醋酸溶液 (6)0.01 mol/L醋酸溶液 (7)1.00 mol/L的醋酸溶液 (8)0.02 mol/L 氢氧化钠溶液
      • 酪蛋白乙酸钠溶液配制：称取纯酪蛋白0.25克，加蒸馏水20毫升及1.00mol/L氢氧化钠溶液5毫升（必须准确） 摇荡使酪蛋白溶解。然后加1.00mol/L醋酸5毫升(必须准确)，倒人50毫升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋白溶于0.10mol/L乙酸钠溶液中，酪蛋白的浓度为0.5%
  • 实验操作
    • 蛋白质的两性反应
      • 1、取1支试管，加0.5%酪蛋白溶液20滴和0.01%溴甲酚绿指示剂5—7滴，混匀。观察溶液呈现的颜色，并说明原因。 2、用细滴管缓慢加入0.02mol/L盐酸溶液 随滴随摇直至有明显的大量沉淀发生 此时溶液的pH按近于酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。 3、继续滴入0.02mol/L盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化.并说明原因。 4、再滴入0.02mol/L氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。继续滴入0.02mol/L氢氧化钠溶液 为什么沉淀又会溶解？溶液的颜色如何变化？说明了什么问题？
    • 酪蛋白等电点的测定
      • 1、取7支粗细相近的干燥试管，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂·加入每种试剂后应混合均匀。 ·2、静置约20分钟，观察每支试管中溶液的混浊度，以一，十，十十，十十十，十十十十符号表示沉淀的多少。根据观察结果指出哪一个pH是酪蛋白的等电点？ 该实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。实验中应严格按照定量分析的操作进行。
  • 实验现象及结果
    • 蛋白质的两性反应：溴甲酚绿作用是指示化学计量点，由于酪蛋白的等电点大概是pH是4.7的时候，而溴甲酚绿在4.5时就有颜色变化，因此更好观察等电点左右沉淀变化现象。
      • 化学计量点定义：在滴定分析法中，一般现将试样配成溶液并置于一定容器中，用一种已知准确浓度的溶液即标准溶液通过滴定管逐滴地滴加到被测物质的溶液中，直至所加溶液物质的量与被测物质的量按化学计量关系恰好反应完全，所加标准溶液与被测物质恰好完全反应的这一点称为化学计量点。 溴甲酚绿变色范围：pH3.6～5.2(黄→蓝)。pH=3.8时呈黄色，pH=5.4时呈蓝绿色，pH=4.5时开始有颜色的明显变化。
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      • 产生原因：蛋白质在等电点时，因为没有相同电荷而互相排斥的影响，所以最不稳定，溶解度最小，极易借静电引力迅速结合成较大的聚集体，因而沉淀析出。
    • 酪蛋白等电点的测定:进行最后摇匀混浊度的比较，发现1,6,7试管很少基本没有，2,5差不多浑浊度一样，但都相对较少，3,4号 都很多，但感觉三号比较多，判定3号为等电点的pH。
      • 分析按理论等电电应该出现在4号管子， 可能在移液过程中，移液取的不准确， 导致误差。
• 思考题
  • 呈色反应： 1、生物学实验中为什么要设置“对照组”？ 对照是实验所控制的手段之一，目的在于消除无关变量对实验结果的影响，增强实验结果的可信度． 2、对照设置的基本原则有哪些？ (1)单一变量原则(2)对照性原则(3)等量原则 沉淀反应： 1.名词解释：等电点？ 等电点是一个分子表面不带电荷时的pH值。是针对带电荷的物质而言，不只限于两性电解质如氨基酸和蛋白质。 2.实验设计题： 以一份鲜牛奶为样本，提取获得酪蛋白纯品。请简要描述你的设计思路(字数控制在100字以内) 用等电点沉淀法沉淀酪蛋白，用某种酸溶液调 pH到酪蛋白的等电点的pH，然后加入牛奶，将会析出沉淀，就是酪蛋白的粗产物。进行过滤。之后再进行系列纯化。 两性反应： 1、沉淀、变性之间有什么样的关系？哪些沉淀往往伴随变性？ 沉淀基本上因为溶液中物质的量大于溶解度，就会产生溢出沉淀。 变性是一种特殊的状态，对于蛋白质而言，变性会导致疏水残基暴露，而减低溶解性，并产生集聚，而沉淀。不过通过适当控制条件，变性不一定沉淀的，还可以通过环境条件的改变而复性。所以变性而伴随沉淀。沉淀是变性一种可能结果。 重金属离子和某些有机酸离子和生物碱试剂沉淀蛋白质都是变性。 2、鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解毒剂？ 因为鸡蛋清含有大量的蛋白质，大量蛋白质来结合重金属离子，从而使其尽可能少的与人体的功能蛋白结合，以此解毒。 3、氯化汞为何能做为杀菌剂？ 一般细菌组成有蛋白质。氯化汞是重金属盐，汞离子是重金属离子，蛋白质分子能与带正电的金属离子结合形成蛋白质盐，发生蛋白质的不可逆沉淀反应（重金属离子沉淀蛋白质），所以氯化汞可以电离出一些汞离子，汞离子对于硫元素有强的亲和力，故易和含硫蛋白质结合使之变性，最终导致细菌死亡。
• 呈色反应
  • 五个反应
    • 双缩尿反应
      • 实验原理
        • 参与的反应化学键：酰胺键
          • 注：一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩 服反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
      • 实验试剂
        • ①尿素 ②10%氢氧化钠溶液 ③1%硫酸铜溶液 ④2%卵清蛋白溶液
      • 实验操作
        • 尿素：取少量（小半勺）尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化，尿素放出氨。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。添加要避免过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
        • 2%卵清蛋白溶液：向另一试管加卵清蛋白溶液约0.5ml和10%氢氧化钠溶液约1ml摇匀，再加1%硫酸铜溶液1~2滴，随加随摇。
      • 实验现象
        • 尿素：由无色变为粉红色 2%卵清蛋白溶液：由无色变为紫蓝色
      • 实验结果
        • 尿素：观察到出现粉红颜色 2%卵清蛋白溶液：观察到紫蓝色出现
    • 茚三酮反应
      • 实验原理
        • 参与反应的化学键：游离的氨基和羧基
      • 实验试剂
        • （1）蛋白质溶液 (2) 0.5%甘氨酸溶液 (3) 0.1%茚三酮水溶液 (4) 0.1%茚三酮-乙醇溶液
      • 实验操作
        • 取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟。
      • 实验现象
        • 蛋白质溶液：无颜色☞淡紫色☞淡蓝紫色 甘氨酸溶液：无颜色☞深紫色☞深蓝紫色
          • 分析：按理论应该看到粉红色， 但是过程中并没有观察到， 原因可能是反应在颜色过渡时比较快， 就很快呈现紫色，没有观察到。
      • 实验结果
        • 蛋白质溶液：蓝紫色 甘氨酸溶液：蓝紫色
    • 黄色反应
      • 实验原理
        • 参与反应的化学键：苯环
    • 乙醛酸反应
      • 实验原理
        • 参与反应的化学键：吲哚环 
      • 实验试剂
        • 1)蛋白质溶液 2)冰醋酸 3）浓硫酸
      • 实验操作
        • 向试管中加数滴蛋白质溶液，再加冰醋酸约1ml，倾斜试管，谨慎地沿着管壁加浓硫酸(A. R.)约1ml，使其重叠，勿使两者混合。静置后观察。可以在水浴中微热，可帮助颜色形成。
      • 实验现象
        • 分层但无颜色变化
      • 实验结果
        • 无变化
          • 分析：按理论应该是在分层处有红紫色环，但是并没有出现，原因很可能是蛋白质中色氨酸含量很低很低，导致无法看出现象。
    • 考马斯亮蓝反应
      • 实验原理
        • 考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。在0.01~1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。
      • 实验试剂
        • 1)蛋白质溶液 2）考马斯亮蓝染液
      • 实验操作
      • 实验现象
        • 试管1：考马斯亮蓝滴到蒸馏水中是墨绿色 试管2：考马斯亮蓝滴入蛋白质溶液时墨绿色变为蓝色
      • 实验结果
        • 试管1：墨绿色 试管2：蓝色
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