氨基酸的分离鉴定的实验

这是一篇关于氨基酸的分离鉴定的实验的思维导图，包括纸层析法和纸电泳法进行氨基酸的分离鉴定实验报告的思维导图

氨基酸的分离鉴定

• 纸电泳
  • 实验目的
    • 1、了解电泳分离的基本原理。
    • 2、掌握纸上电泳分离氨基酸的操作技术。
    • 3、了解纸上电泳技术的实际应用。
  • 实验原理
    • 带电分子在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。由于待分离样品中各种分子(组分)的组成、性质不同，以及各种分子各自的大小、形状等有差异，因而，在同一电场作用下，不同的带电分子泳动的方向和速度也有差异，所以，通过电泳可以达到对混合样品进行分离、鉴定或提纯的目的。
  • 实验用具
    • 实验试剂
      • (1) 硼酸缓冲液(pH 8.0):称取2.86克硼砂和4.33克硼酸用蒸馏水溶 解，稀释至1000毫升。 (2) 氨基酸混合液:含Glu、Arg、 Asp等的氨基酸混合(2mg/mL ) (3) 0.1%茚三酮正丁醇溶液。 (4) 标准氨基酸: Glu、 Arg、 Asp等标准氨基酸(2mg/mL )
    • 实验器材
      • (1) 滤纸条(3X 15cm)(2)玻板(3) 高压电泳仪(4)镊子(5)点样器(6) 电吹风(7)培养皿(8) 电热鼓风干燥箱(9)喷雾器(10) 水平电泳槽(11)剪刀、针、线、尺等
  • 实验操作
    • 1、准备:裁剪为长15cm,宽3cm的新华滤纸。在纵向中间用铅笔划一条线，在中点处打一点作为原点。在距中线两边各1.5cm处用铅笔各轻微地划一条与中线平行的虚线。
    • 2、点样:用点样器在原点中央点样。每次点少量，吹干再点，标准液点样法同样品，每一个电泳槽中放一条点有一组标准氨基酸的滤纸条(6X15cm的滤纸条)
    • 3、湿润滤纸:用镊子夹着滤纸条，将其两端浸入电泳液中，浸湿前沿分别到达虚线即可。
    • 4、把滤纸放入电泳槽,拉平，正极对正极，负极对负极，盖好盖子。当滤纸被缓冲液浸湿完全渗湿后，通电，800伏，50 min。断电后，再取出滤纸，用冷风吹干滤纸。
    • 5、染色:用木夹夹住将滤纸浸入茚三酮显色剂后，立即拿出,迅速置于85°C烘箱中约5 ~10 min烘干显色，检查标准氨基酸和混合，样品的电泳结果。
  • 实验结果
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    • 第一个结果是我们组判断的结果，由于对理论知识掌握不好，刚好判断反了。由于缓冲液是pH=8，lys和Arg等电点都大于8，所以它们本身带正点，应向负极移动。Asp的等电点小于8,它应该带负电，应像正极移动。lys和Arg的等电点Arg更高些那带点荷应该更高跑得更远。因此图二才是正确结论。
      • 当时分析时，可能是正负极标反了，也可能是由于电渗作用导致，可我看了其他组同学的，位置是一致的，很大可能就是理论知识不牢固，判断错误了。
  • 注意事项
    • 喷完茚三酮，要贴着纸用热风吹干。
    • 润湿滤纸时不能超过两端的虚线，以免在未通电的情况下样品晕开，导致影响实验结果位置。
  • 思考题
    • 1、除了纸电泳外，你还知道哪些电泳方法?它们主要用来分离什么物质?
      • 醋酸纤维薄膜电泳：血清蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白等 琼脂糖凝胶电泳法：大分子核酸、病毒等 聚丙烯酰胺凝胶电泳法：用于分离蛋白质和寡核苷酸等
    • 2、简耍叙述电泳的基本原理。
      • 带电分子在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。由于待分离样品中各种分子(组分)的组成、性质不同，以及各种分子各自的大小、形状等有差异，因而，在同一电场作用下，不同的带电分子泳动的方向和速度也有差异，所以，通过电泳可以达到对混合样品进行分离、鉴定或提纯的目的。
    • 3、简要叙述四种常见的电泳各自的分离原理及其效果。
      • 纸电泳：根据电泳现象在渗透了缓冲液的滤纸加上电场使物质移动的电泳法。也就是把样品以带状加在作为支持体的滤纸内来检测其移动和分离的方法。
      • 醋酸纤维薄膜电泳：它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm-0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好;太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。
      • 琼脂糖凝胶电泳法：琼脂糖凝胶电泳法是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大。
      • 聚丙烯酰胺凝胶电泳法：聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带
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• 纸层析
  • 实验目的
    • (1)了解层析的基本原理。
    • (2)学习分配层析的基本原理和操作方法。
    • (3)掌握纸层析分离氨基酸的基本原理和操作技术。
  • 实验原理
    • 层析是一种分离技术。无论何种层析，都是由互不相溶的两个相组成:相是固定相(固体或吸附在固体上的液体)，一相是流动相(液体或气体)。层析时，利用混合物中各组分理化性质差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相.上流过，不同组分将以不同速度移动而最终被，分离。纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，纸层析中能吸附一层水作为固定相，而有机溶剂作为流动相。分配层析是利用不同的物质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用a表示分配系数。 Q=溶质在固定相的浓度Cs/溶质在流动相的浓度Cl 一种物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。
  • 实验用具
    • 实验试剂
      • (1)扩展剂: 4份水饱和的正J醇和1份醋酸的混合物。将20毫升正丁醇和5毫升冰醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5毫升置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。 (2)氨基酸溶液: 0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸溶液等及它们的混合液。 (3) 显色剂: 0.1%水合茚三酮-乙醇溶液。
    • 实验器材
      • (1)层析缸(2)毛细管(3)喷雾器(4)培养皿(5) 层析滤纸(6)电吹风 (7) 电热鼓风干燥箱(8)手套(9)针、线、尺(10)小烧杯(11)镊子
  • 实验操作
    • 1、平衡:将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。
    • 2、取层析滤纸( 长20厘米，宽14厘米)一张。距边缘2~3厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2~3厘米作一记号，作为点样位置。
    • 3、点样:用毛细管将各氨基酸样品分别点在这几个位置上。风干后再点1~2次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3毫米。
    • 4.扩展:用线将滤纸缝成筒状，注意两边缘不能接触。将盛有约20毫升扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1厘米。待溶剂上升15厘米左右时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，风干。
    • 5、显色:用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮溶液;然后置烘箱中烘烤5分钟或用热风吹干即可显出各层析斑点，用铅笔将图谱上的斑点圈出，找出各斑点的中心点。
  • 实验结果
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    • 根据数据可以得出样品中应含有辅氨酸，甘氨酸，亮氨酸。快慢是由其极性及溶解度影响，极性越高跑得越慢，极性越低跑得越快。比较氨基酸当中R基团的极性，大概可以推断出各个氨基酸跑得快慢。
  • 注意事项
    • 滤纸：剪层析滤纸,点样等过程中要注意尽量不用手接触样品要经过的地方；因为纸层析比较灵敏,手上的一些物质也可能会显示,干扰结果.
    • 点样：不要损伤点样处的滤纸,不要让原点直径大于5mm,样品含量不能超过滤纸承载量；否则会出现层析点太大不能分开或拖尾严重.
    • 扩展:用线将滤纸缝成筒状，注意两边缘不能接触。层析液不可以超过直线，避免样点融入层析液，也是为了能让样品同时展开。
    • 注意用铅笔在滤纸上角做记号,避免遗忘。
    • 喷完茚三酮，要贴着纸用热风吹干。
  • 思考题
    • 1、纸层析分离氨基酸的原理是什么?
      • 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，纸层析中能吸附一层水作为固定相，而有机溶剂作为流动相。分配层析是利用不同的物质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。层析时，利用混合物中各组分理化性质差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相.上流过，不同组分将以不同速度移动而最终被，分离。
    • 2、何谓R值?简要叙述影响Rf值的因素是什么?
      • Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。 在一定的条件下某种物质的Rf是一个常数。Rf的大小与样品物质的结构、性质、溶剂系统、层析纸的质量溶剂系统的pH值、层析温度等图素有关此外，盐分、其他杂质、点择过多等都会影响样品的有效分离。
    • 3.除了纸层析法外，你还知道哪些层析法，各层析法分离样品的原理是什么?
      • 1.凝胶层析：固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度（移动速度）也不同。 优点：所用凝胶属于惰性载体，吸附力弱，操作条件温和，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分离效果。 凝胶层析可用于脱盐、分离提纯、测定高分子物质的分子量、高分子溶液的浓缩等。
      • 2.离子交换层析：采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。 主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。
      • 3.高效液相层析：具有分离能力强、测定灵敏度高、可在室温下进行、应用范围广等优点，对分离蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤其有利。
      • 4.亲和层析：利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质才能被固定相吸附结合，无关组分随流动相流出。亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。 具有专一亲和力的生物分子对主要有： 抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物，激素与受体，维生素与特异结合蛋白，糖蛋白与植物凝集素等。 亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。