生物化学蛋白质化学测序作业

这是一篇关于生物化学蛋白质化学测序作业的思维导图，断裂二硫键常采用过甲酸氧化法或二硫苏糖醇还原法。强氧化剂过甲酸可定量打开胱氨酸残基的二硫键，生成基丙氨酸残基。还原剂巯基化合物，如二硫苏糖醇，也能断裂二硫键，生成半胱氨酸残基及相应的二硫化物。

蛋白质一级结构测定

• （1）确定蛋白质分子中多肽链的数目
  • 根据蛋白质末端残基的分析可以确定蛋白质分子中不同多肽链的数目（种类），因为不同的多肽链一般含有不同的末端残基。如果蛋白质只含一种多肽链，则可能是单体蛋白质或是同多聚蛋白质；蛋白质摩尔数与末端基摩尔数相等，则是单体蛋白质；末端基摩尔数是蛋白质摩尔数的整倍数，则是同多聚蛋白质。如果蛋白质含有两种或多种多肽链，则是杂多聚蛋白质。
• （2）拆分蛋白质分子的多肽链
  • 如果是多聚（寡聚）蛋白质，则其多肽亚基必须加以拆分。如果这些多肽链是借助非共价键相互作用缔合的，则可用变性剂如尿素、盐酸胍或高浓度盐进行处理，就能使蛋白质的亚基分开。如果多肽链间是通过共价二硫键交联的，如胰岛素（含两条多肽链）和α-胰凝乳蛋白酶（含3条多肽链），则须采用氧化剂或还原剂将二硫键断开。
• （3）断裂多肽链内的二硫键
  • 断裂二硫键常采用过甲酸氧化法或二硫苏糖醇还原法。强氧化剂过甲酸可定量打开胱氨酸残基的二硫键，生成基丙氨酸残基。还原剂巯基化合物，如二硫苏糖醇，也能断裂二硫键，生成半胱氨酸残基及相应的二硫化物。
• （4）分析每一多肽链的氨基酸组成
  • 氨基酸自动分析仪进行测定
• （9）确定二硫键的位置
  • 对角线电泳法
    • 对角线电泳是：把水解后的含二硫键的混合肽段点到滤纸的中央，在pH6.5的条件下，进行第一向电泳。然后把滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使S-S断裂。此时每个含二硫键的肽段被氧化成一对含磺基丙氨酸的肽。滤纸旋转90°角，在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。在这里，大多数肽段的迁移率未变，并将位于滤纸的一条对角线上，而含磺基丙氨酸的成对肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离了对角线。肽斑可用茚三酮显色确定。将每对含磺基丙氨酸的肽段（未用茚三酮显色的）分别取下，进行氨基酸序列分析，然后与多肽链的氨基酸序列比较，即可推断出二硫键在肽链间或（和）肽链内的位置。
• （8）重建完整多肽链的一级结构
  • 重叠肽
    • 不同的断裂方法是指断裂的专一性不同，即切口是彼此错位的，因此两套肽段正好相互跨过切口而重叠，这种跨过切口而重叠的肽段称重叠肽，借助重叠肽可以确定肽段在原多肽链中的正确次序，拼凑出整个多肽链的氨基酸序列
• （7）测定各肽段的氨基酸序列
  • Edman化学降解法
    • 此法最早用于鉴定N端残基。降解试剂苯异硫氰酸酯（PITC）与肽链反应只标记和除去一个N端残基，肽链的其余肽键不被水解。N端残基被除去并鉴定后，剩下的肽链暴露出一个新的N端残基，可与PITC发生第二轮反应。实际上分析时常把肽链的羧基端与不溶性树脂偶联，这样每轮Edman反应，只要通过过滤即可回收剩余的肽链，以利反应循环进行。理论上讲，进行n轮反应就能测出n个残基的序列。
  • 蛋白质序列仪测定
    • 蛋白质序列仪的出现既免除了手工测定的麻烦，又满足了蛋白质微量序列分析的需要。该仪器的灵敏度高，蛋白质样品的最低用量在5p mol水平。
  • 质谱法
    • 质谱法的基本原理是待测样品也称分析物在质谱仪的离子源中通过一定方式发生电离；生成的荷电分子和／或荷电分子碎片在质量分析器中，通过磁场或其他方式的作用下，按它们的质荷比大小分开，并依次冲击离子检测器，在记录仪的图纸横坐标上相应的m／z位置以峰或线的形式出现，峰高反映冲击检测器的、具有特定m／z的离子的数目，以纵坐标上的强度表示。
• （6）裂解多肽链成较小的片段
  • 酶裂解法
    • 选用专一性强的蛋白酶或化学试剂进行有控制的裂解。裂解时要求断裂点少，作用专一性强，反应产率高
  • 化学裂解法
    • 化学裂解法主要应用溴化氰，它只断裂甲硫氨酸残基的羧基侧肽键。
• （5）鉴定多肽链的N端和C端残基
  • 末端残基分析
    • 利用二硝基氟苯与多肽的游离末端氨基反应，成键对酸远比肽键稳定，因此产物酸解后，N端残基以黄色的DNP-氨基酸被释放，其余为游离氨基酸。用于标记N端残基的试剂还有丹磺酰氯和达磺酰氯.
    • C端残基主要采用羧肽酶法测定。羧肽酶是一类肽链外切酶，称为外肽酶，它专一地从肽链的C端逐个降解，测定逐个释放的氨基酸，可推断出C端残基和C端的一小段肽的序列。