体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

体外哺乳动物细胞染色体畸变试验：包含评价受试样品的致突变性及其强度，培养皿（瓶）、10ml离心管、载玻片、滴管、离心机、水浴箱、生物显微镜（×100物镜）等等

体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

• 试验目的
  • 评价受试样品的致突变性及其强度
• 器材与试剂
  • 器材
    • 培养皿（瓶）、10ml离心管、载玻片、滴管、离心机、水浴箱、生物显微镜（×100物镜）
  • 试剂
    • 培养液
      • 非必需氨基酸、抗生素、10%胎牛血清/小牛血清
    • 代谢活化系统
      • 肝混合功能氧化酶混合液 (S9混合液）
    • 0.04%秋水仙素
      • 40mg秋水仙素溶解于100ml无菌0.85%氯化钠溶液，过滤除菌
    • 0.07mol/L 氯化钾溶液
    • 固定液
      • 甲醇：冰醋酸=3：1，临用前配制
    • 磷酸盐缓冲液（1/15mol/L，pH6.8）
    • 吉姆萨染液
• 实验设计
  • 细胞株
    • 中国地鼠肺（CHL）细胞株或卵巢（CHO）细胞株、人或其他哺乳动物外周血淋巴细胞
  • 受试样品
    • 固体受试样品可以溶解或悬浮于合适溶剂中，并稀释至一定浓度，液体受试样品可直接使用或予以稀释
  • 剂量
    • 受试样品应至少取3铬检测剂量，检测范围应该覆盖两个10倍稀释系列
    • 对有细胞毒性的受试样品，最高剂量应能明显减少细胞计数或有丝分裂指数（>50%）
    • 对无细胞毒性或细胞毒性很小的受试物，最高剂量应达到5ug/ml、5mg/ml或0.01M
    • 应在预实验中确定细胞毒性和溶解度
  • 对照组
    • 阳性对照物
      • 无外源性代谢活化系统
        • 甲磺酸甲酯（MMS）、甲磺酸乙酯（EMS）、丝裂霉素C、乙基亚硝基脲（ENU）、硝基喹啉-N-氧化物等
      • 有外源性代谢活化系统
        • 苯并（a）芘（BaP）、环磷酰胺等
    • 阴性对照物
      • 水
      • 二甲基亚砜（DMSO），浓度≦0.5%
• 操作步骤
  • 细胞培养与染毒
  • 收获细胞与制片
• 结果分析
  • 计算指标
    • 每个细胞畸变数
    • 染色体结构异常百分率
    • 各剂量组和对照组不同类型染色体异常数和频率
  • 统计方法
    • 泊松分布
    • 二项分布
    • Dunnet-t 检验
    • 卡方检验
  • 阳性结果判断
    • 受试样品引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义，并有与剂量相关的增加
    • 受试样品在任何一个剂量条件下，引起具有统计学意义的改变，并有可重复性
• 注意事项
  • 低渗是本实验的关键，控制好低渗时间，做出分散良好的染色体标本，关系到实验结果的准确性
• 操作步骤
  • 培养细胞
    • 实验前一天将细胞放入培养皿中， 放入二氧化碳培养箱内培养
  • 吸去培养皿中的培养液，加入一定浓度受试样品、S9混合液以及一定量不含血清的培养液
    • 不加S9混合液时，需用培养液补足
  • 吸去含受试样品的培养液、用Hanks液清洗细胞3次，加入含10%胎牛血清的培养液
  • 放回培养箱
    • 于24小时内收获细胞
  • 放入培养箱，根据细胞周期处理2~6小时
  • 于收获前2~4个小时，加入细胞分裂中期阻断剂
    • 如秋水仙素，作用时间4小时，终浓度为1mg/ml
  • 收获细胞
  • 消化
    • 用0.5%的胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱落后，加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以1000~1200rpm的速度离心5~7分钟，弃去上清液
  • 低渗
    • 加入0.075mol/L KCl 溶液7ml，用滴管将细胞轻轻地混匀，放入37℃水域中低渗处理7分钟，加入2ml固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）混匀，以1200rpm的速度离心5~7分钟，弃去上清液
  • 固定
    • 加入7ml固定液，混匀后固定7分钟，以1500rpm的速度离心7分钟，弃去上清液。同法再固定1~2次，弃上清
  • 制片
    • 加入数滴新鲜固定液，混匀。用混悬液滴片，自然干燥，用吉姆萨染液染色10~20分钟，取出清洗，自然晾干
  • 阅片
    • 每片选择100个分散良好的中期分裂相，在显微镜油镜下进行读片。主要观察染色体的数目改变和结构改变