导图社区 WB蛋白质印迹技术
WB蛋白质印迹法(Western blot) 蛋白质印迹法(免疫印迹实验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。用于样品特定蛋白在样品中表达相对表达量进...
口组第五单元,详细列出了口腔黏膜的组成部分,包括“上皮层”、“基底膜”和“固有层”。上皮层是口腔黏膜的外层,直接与外部环境接触。基底膜则位于上皮层与固有层之间,起到连接和支撑的作用。固有层是口腔黏膜的主要组成部分,由致密的结缔组织构成,其中包含有大量的成纤维细胞,这些细胞对上皮的分化具有调控作用。
口组第四单元,内容涵盖了牙周组织的多个方面,包括其结构、细胞组成、生物学特性以及与其他组织的关联等。概述了牙周组织的生物学特性,如增龄变化、牙骨质等。这些特性描述了牙周组织在不同年龄阶段的变化和特征,以及牙骨质在牙周组织中的作用和重要性。
口组第三单元,包含牙釉质、牙骨质、牙本质、牙髓等内容,知识点系统且全面,有助于学习者快速定位到关键信息,减少在海量资料中搜索的时间,提高学习效率,可以作为复习的参考资料,帮助学习者在考试前快速回顾和巩固所学知识。
社区模板帮助中心,点此进入>>
《老人与海》思维导图
《傅雷家书》思维导图
《阿房宫赋》思维导图
《西游记》思维导图
《水浒传》思维导图
《茶馆》思维导图
《朝花夕拾》篇目思维导图
英语词性
生物必修一
高中物理知识点思维导图
WB
Western Blotting 蛋白质印迹技术 中文名“蛋白印迹”,通过电泳区分不同的蛋白组分,并转移至固相支持物,通过特异性抗体作为探针,对靶蛋白进行检测 。
样本制备
细胞和组织裂解,释放蛋白。 细胞裂解液中常用的组分及作用 
测蛋白浓度
确定上样量;使各样本上样量接近。
紫外分光光度法
大量样本,快速 蛋白质溶液在275~280nm处有一紫色吸收高峰。在一定范围内,蛋白质的A280与其浓度成正比。 会受核酸干扰,一般还得测A280比A260的值。
BCA法
准确性好,较快,排除核酸干扰;还原剂不兼容,受螯合剂 EDTA EGTA 、 还原剂DTT 巯基乙醇和脂类的影响 。 碱性溶液中,蛋白质将二价铜还原成一价铜,后者与测定试剂(苹果绿)中的BCA形成一个在562nm处具有最大光吸收的紫色复合物。复合物的光吸收强度与蛋白质浓度呈正比。 
染料结合 Bradford 法
考马斯亮蓝法 反应迅速(2min左右达到平衡),结合物在室温下1h内保持稳定 受高浓度去垢剂影响,使用SDS裂解液(1%SDS)的样本不适用 考马斯亮蓝G-250具有红色和蓝色两种色调,在酸性溶液中,其以游离态存在呈棕红色(465nm),它与蛋白质通过疏水作用结合后,变为蓝色(595nm)。在0.01~1.0mg蛋白质/ml范围内,蛋白质含量与A595值呈正比。
蛋白变性
消除蛋白质空间结构和带电荷的差异,使线性化并均匀的带上负电荷。 破坏二硫键,形成单体;使蛋白带有均匀负电荷;加热使蛋白成线性、暴露抗原表位 变性液:DTT 和 β 巯基乙醇(破坏二硫键); SDS 让所有蛋白带上负电荷;甘油保证样品沉淀在底部。 DTT 见光失效( 20kd 却出来 40kd 条带) 常用方法:95~100℃变性 5~10 分钟。
电泳分离
实现不同大小蛋白的分离(蛋白大小和负电荷成正比) 胶的选择:预制胶、自制胶、胶浓度 上样:30μg 总蛋白, 100ng 纯化蛋白。 电泳:80V (浓缩胶,使蛋白在同一起跑线) 120V (分离胶) 
转膜
胶有一定厚度,抗体难以进入胶内,所以要转膜。  胶和膜顺序不能错 转膜时电阻大产热大,要在冰上进行 转膜效率检测:marker ,考马斯亮蓝染色(染膜)、丽春红染色(染胶)。
封闭
消除非特异性结合位点,杂蛋白封闭。 去除非特异性信号,提高信噪比。 封闭液:脱脂奶粉,BSA,血清。 封闭条件:时间,浓度,温度。 不同的体系(抗原、抗体、检测体系)需要不同的封闭液。
抗体孵育
抗体本质是糖蛋白,不能反复冻融(有甘油不结冰),应当分装。 回收利用:加叠氮化钠抑制细菌生长,放4℃ 
检测
曝光时间:连续曝光。曝光时间建议2-10min
图5 内参选择
避免和靶蛋白相同大小,根据样本选择 。
常见问题
合理选材,标准化操作,设置对照组,逐步排除。
信号弱或者无信号
实验样本:蛋白表达丰度低;蛋白提取不充分;蛋白发生降解;蛋白定量不准确; 实验材料:裂解液和酶抑制剂使用不当;抗体效价低;显影液灵敏度不够 实验操作:封闭不恰当;转膜有问题;抗体使用不当;抗体浓度低,孵育时间短;曝光时间太短
条带大小与预期不符
实验样本:蛋白翻译后修饰(去糖基、泛素化...多次跨膜蛋白不能煮沸);活性蛋白剪切;蛋白剪接变异体;蛋白质表面电荷影响;多聚体;蛋白降解 实验材料:抗体特异性不强;蛋白marker不准确 实验操作:实验条件和样品处理不当
非特异条带
实验样本:蛋白翻译后修饰;活性蛋白剪切;蛋白剪接变异体;蛋白质表面电荷影响;多聚体;蛋白降解;上样量太多 实验材料:抗体特异性不强;封闭液不恰当 实验操作:抗体浓度不高;洗膜不充分;曝光时间太长
其他典型问题
内参问题:避免和靶蛋白相同大小,根据样本选择。 笑脸条带:凝胶不均匀冷却,中间冷却不好,电流不均,梳孔不平。  哭脸条带:凝胶和玻璃挡板底部有气泡,凝胶两边聚合不完全,梳孔不平。 条带偏斜:电极不平衡、胶不均一,加样位置偏斜。 条纹状条带:样本盐离子浓度高,泳道偏窄,热效应扩散作用。  黑色泳道:蛋白浓度过高,封闭液不当,不溶性颗粒物。  拖尾问题:样品溶解不好、有不溶性颗粒、靶蛋白翻译后修饰。 鬼带(中间白,四周黑):降低上样量或者抗体浓度。  条带变黄:蛋白丰度太高、抗体浓度过高。  带中有亮点:转膜有气泡、油脂污染等。
图4 注意事项
图2 原理
图1 原理:抗原-抗体特异性反应
图3 对蛋白进行定性分析、定量分析,检测蛋白的时空表达变化情况
IGF-2、CCNYL1:目的蛋白 β-actin:胞质内参蛋白 N-cadherin:胞膜内参蛋白