分子生物学思维整理

这是一篇关于分子生物学思维整理的思维导图，主要内容有DNA重组与重组DNA技术、分子生物学技术、基因结构功能分析和疾病相关基因鉴定克隆、基因诊断和治疗。

分子生物学

• DNA重组与重组ＤＮＡ技术
  • Recombinant DNA technology =molecular cloning =DNA cloning=genetic engineering
  • 自然界的ＤＮＡ重组和基因转移
    • 一、 同源重组 homologous recombination
      • Holiday模型
        • 细菌的RecBCD模式
    • 二、 位点特异性重组　
      • 位点特异重组酶 site-specific recombiase, SSR
      • 基因表达调控；发育；病毒DNA整合
        • 1. λ噬菌体DNA的整合
          • 反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)
        • 2. 细菌的特异位点重组
          • 沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变
    • 三、 转座重组 transformation
      • 由插入序列(insertion sequences, IS)和转座子（transposon，Tn）介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。 大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。
        • 1. 插入序列(insertion sequences, IS)
          • 保守性转座(conservative transposition)
          • 复制性转座(duplicative transposition)
        • 2. 转座子(transposon，Tn) ——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。
    • 四、 原核细胞
      • 接合 conjugation
        • 是质粒DNA通过细胞间相互接触（如鞭毛）发生转移的现象【只有大质粒如F Factor才行】
      • 转化 transformation
        • 敏化状态受体细胞自主摄取外源DNA并与之整合的现象
      • 转导 transduction
        • 病毒（如噬菌体）将供体DNA带入受体并与之染色体发生整合的现象
    • 五、 细菌的CRISP/Cas获得性免疫
      • Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins system
  • 重组DNA技术
    • 工具酶
    • 步骤:分，选，连，转，筛，（扩）
      • 转入方式
        • 转化 (transformation)：导入感受态的细菌、真菌 转染 (transfection)：导入真核细胞，常用磷酸钙共沉淀，脂质体融合，显微注射，电穿孔等 感染 (infection)：以病毒为外源DNA的载体导入宿主细胞，如噬菌体、腺病毒等
      • 筛选鉴定方法
        • RE(restriction endonuclease)酶切法
          • 回文序列：palindrome
        • PCR法
        • 核酸杂交法
        • DNA测序法
      • 构建表达载体
        • vector
          • plasmid
          • cosmid
            • A cosmid is a type of hybrid plasmid that contains a Lambda phage cos sequence. Cosmids' (cos sites + plasmid = cosmids) DNA sequences are originally from the lambda phage. They are often used as a cloning vector in genetic engineering. Cosmids can be used to build genomic libraries.
          • YAC 酵母菌人工染色体 Yeast artificial chromosome
          • BAC
• 分子生物学技术
  • 一、 分子杂交与印记技术
    • Southern blotting：基因组DNA的定性定量分析
    • Northern blotting：mRNA的定性定量分析
    • Western blotting：蛋白质的定性定量分析
    • in situ hybrization, ISH 原位杂交：检测染色体，细胞，组织原位的DNA或RNA）（一般使用荧光素标记探针【荧光原位杂交FISH Fluorescence】），基因及其表达产物定位分析
      • chip 技术
        • DNA array DNA点阵 / DNA chip
        • Protein chip
  • 二、 PCR
    • 用途
      • 1. 获取目的基因
      • 2. DNA和RNA微定量分析［基因诊断］
      • 3. ＤＮＡ序列分析　【ＰＣＲ产物直接或克隆后测序】
      • 4. 基因突变分析（提高敏感性）
      • 5. 基因突变【设计引物】
    • 分类
      • 实时PCR　real-time PCR 【实时荧光PRC或荧光定量PCR】
      • 原位PCR in situ PCR
      • RT-PCR
    • 引申
      • PCR-RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）
        • 作为遗传病的诊断指标
      • PCR-SSCP
        • 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism,SSCP）分析是利用DNA或RNA单链构象具有多态性的特点， 产物构象改变->PAGE电泳迁移率改变 ->可被判断为点突变
      • PCR-DHPLC
        • 变性高效液相色谱 产物中是否有异源双链判断是否有新的突变点
      • PCR-ASO
        • allele specific oligonucleotide 等位基因特异性寡核苷酸。 检测点突变，微小的缺失与插入。 可以判断是纯合子还是杂合子。
          • 改进： PCR-RDB reverse dot blot 反向点杂交【把固定在膜上的改为液相中，一次多筛查】
  • 三、 DNA sequencing
    • 经典方法：双脱氧法（Sanger法）&化学降解法
    • 第一代全自动激光荧光DNA测序仪器基于双脱氧法
    • 高通量DNA测序技术(Next generation sequencing, NGS)
      • 原理：对ＤＮＡ样品芯片重复进行反应，通过纤维设备观察并记录连续测序循环中释放的光学信号，从而确定ＤＮＡ序列
      • 第三代测序技术
        • 　使用聚合酶限制ＤＮＡ的复制，给碱基加上荧光失踪标记。
          • HeliScope测序技术 （第二代测序技术一种）
          • 单分子实时技术 single molecular real time technology, SMRT
          • 基于荧光共振能量转移FRET的测序技术
          • 焦磷酸测序（Pyrosequencing）
          • 纳米孔
    • 应用
      • 全基因组测序，转录组测序，全外显子测序，DNA-Protein相互作用测序（染色质免疫共沉淀测序，病原微生物全基因组测序）
  • 四、 生物芯片
    • 1. 基因芯片 gene chip / DNA微阵列 DNA microarray
      • 分析不同细胞或同一细胞不同状态下的基因差异表达
      • 分析基因突变，基因多态性，微生物筛选鉴定，遗传病产前诊断等
    • 2. 蛋白质芯片 protein chip
      • principle: 蛋白质分子间的琴和反应
      • 应用：蛋白质表达谱，蛋白质供能，蛋白质间的相互作用
  • 五、 蛋白质的分离，纯化和机构分析
    • 蛋白质沉淀作用用于蛋白质浓缩与分离
      • 有机溶剂沉淀蛋白质
      • 盐析分离蛋白质
      • 免疫沉淀分离蛋白质
    • 透析和超滤去除蛋白质溶液中的小分子化合物
      • 浓缩
    • 电泳分离蛋白质
      • 1||| SDS-PAGE SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
        • 使得蛋白质表面带同种负电荷，迁移速率只和蛋白质颗粒大小有关。 聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应。
      • 2||| 等电点聚焦电泳 IEE
        • 需要形成连续稳定的pH gradient
      • 3||| 双向凝胶电泳分离蛋白质 2-DGE
        • 第一向：IEE 第二向：SDS-PAGE
    • 层析分离
      • 阴离子交换层析 Chromatograpy
      • 凝胶过滤 gel filtration
        • 分子量大小
    • 蛋白质的一级结构分析
      • 离子交换层析分析氨基酸组分
  • 六、 生物大分子相互作用研究
    • 蛋白质-DNA相互作用研究
      • 电泳迁移率测定 electrophoretic mobility shift assay, EMSA
        • 体外，蛋白质结合后电泳迁移速率变慢
      • 染色质免疫沉淀法 chromatin immunoprecipitation assay, CHIP
        • 体内，相当于获取被蛋白质保护的ＤＮＡ信息。
          • 衍生CHIP on chip
    • 蛋白质相互作用研究
      • 标签融合蛋白结合实验 GST-put-down (His)
        • 带有特定标签tag的纯化融合蛋白作为钓饵，可以被琼脂糖珠洗脱。分析蛋白质分子间的相互作用
      • 酵母双杂交 yeast two-hybrid
        • DNA binding domain
        • transcriptionactivation domain, TAD
      • enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA或ELASA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。
• 基因结构功能分析和疾病相关基因鉴定克隆
  • 基因结构分析
    • (一)确定基因编码区分析技术
      • 1. 生物信息学分析基因编码序列
        • NCBI数据库
        • BLAST算法
      • 2. cDNA文库法分析基因编码序列
        • cDNA末端快速扩增技术，RAGE，rapid-amplification of cDNA end
          • 5'-RAGE
          • 3'-RAGE
      • 3. RNA剪接分析法确定基因编码序列 mRNA alternative splicing
        • 选择性剪接的转录产物可以通过基因表达序列标签（expression sequence tag, EST）的比较进行鉴定
    • （二）基因启动子结构分析技术
      • DNase I足迹法
      • 启动子结构
        • core promoter
        • proximal promoter
          • regulatory elements
        • distal promoter
          • emphasor, silencer
      • TSS: transcription start sites
        • BI: the establishment of TSS Database
        • Directly cloning sequencing
        • 5'-RAGE
    • # (三) 拷贝数-表达丰度
      • Southern sploting
      • real time (quantative) PCR
      • DNA sequencing
    • (四)四、分析基因表达的产物可采用组学方法和特异性测定方法
  • 基因功能分析
• 基因诊断和治疗
  • 基因诊断
    • 是指利用分子生物学技术和方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。
    • 优势
      • 病因诊断
      • 特异性强
      • 灵明度高
      • 实用性强，范围广
    • 流程：基因抽提，目的序列扩增，分子杂交，信号检测
  • 基因治疗 Gene Therapy
    • 概念：以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗，即将人正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因，针对的是疾病的根源，即异常的基因本身。
    • 基本策略
      • 原位修复（矫正 correction）
      • 基因添加 augmentation 主要
      • 基因失活 inactivation / 基因沉默 silencing
      • 自杀基因
    • 基本程序：分选（连）选（靶细胞）转筛
• 组学与系统生物医学
  • 基因组学
    • 结构基因组学---基因组序列信息
      • HGP： human genome project
      • 遗传作图（连锁作图）
        • 相对遗传距离： cM
        • 标志位点：RFLP, VNTR, SNP
  • 转录物组学
    • 采取整体性分析技术
      • SAGE 基因表达的系列分析
        • cDNA 3'端特定位置
      • CAGE 基因表达的帽分析
  • 蛋白质组学
    • 翻译后修饰分析
    • 结构与鉴定
      • 2-DE， MS， LC 液相色谱 liquid chromatography
    • 蛋白质相互作用
  • 代谢组学
  • 其他组学
    • 糖组学
    • 脂组学
  • 系统生物医学
    • 分子医学
      • 研究疾病遗传性基础
        • positional cloning
        • SNPs分析 （single nucleotide polymorphism）