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基因工程、分子生物
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编辑于2023-02-18 11:49:25 福建省- 分子生物
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基因工程
基因表达调控的研究
基因表达：遗传信息的转录和翻译 基因表达的调控：转录水平和翻译水平 原核生物：转录和翻译同时发生，调控主要发生在转录水平 真核生物：转录和翻译时空上是分开的，在其后都有复杂的加工过程，表达调控可以发生在不同的水平，主要表现在对上游调控序列、信号转导、转录因子及 RNA 剪辑等方面
DNA 重组技术 基因工程：是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种 DNA 分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的遗传技术。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
质粒：环形闭合的双股DNA质粒：细菌染色体外的遗传物质，为环形闭合双股 DNA ,质粒编码非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等，质粒具有可自主复制传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关
真核生物的染色体 真核生物（ eukaryotes ）由真核细胞构成的生物。包括原生生物界、真菌界、植物界和动物界。真核生物是所有单细胞或多细胞的、其细胞具有细胞核的生物的总称，它包括所有动物、植物、真菌和其他具有由膜包裹着的复杂亚细胞结构的生物。真核生物与原核生物的根本性区别是前者的细胞内有以核膜为边界的细胞核，因此以真核来命名这一类细胞。许多真核细胞中还含有其它细胞器如线粒体、叶绿体、高尔基体等 染色质，用以描述细胞核中能被碱性染料强烈着红色的物质。
原核生物和真核生物基因的组成差异 原核生物和真核生物的基因组成大体上都分为编码区和非编码区 不同点： 真核细胞中染色质分为两部分，一部份为行使正常基因表现的常染色质，一部分为固缩状态，称为异染色质。异染色质通常为不活化状态。 真核细胞的基因编码区是不连续的，含有许多内含子，或是重复的基因，但个基因最后只能翻译出一个蛋白质。 原核细胞无内含子，基因编码区是连续的，一个操作子最后可以翻译出多个蛋白质。
起始 RNA 引物的去除 RNaseH ,核糖核酸酶以是一个非序列特异性内切酶家族，又称核酸内切酶 RNase H 。通过水解机制催化 RNA / DNA 底物中 RNA 的切割。从细菌到古细菌到真核生物，核糖核酸离 H 家族的成员几乎可以在所有生物中找到。 所有 RNase H 都具有以由天冬氨酸和谷氦酸残基组成的保守序列基序为中心的活性位点，通常称为 DEDD 基序。这些残基与催化所需的镁离子相互作用。二级结构也在核苷酸底物的结合中起间接作用。 与 DNA 末端直接连接的核糖核苷酸由 DNA 聚合酶I的5'-3'外切酶活性去除，因为 RNase H 只能断裂2个核糖核苷酸之间的键 引物去除后，在双链 DNA 中留下的缺口，由 DNA 聚合酶填补此缺口，使每个核苷酸都碱基配对，形成完整的 DNA 分子，但连接处有一个3'- OH 和5'- P 之间断裂的间断。 DNA 连接酶能使间断的3'- OH 和5'- P 相连接，形成磷酸二酯键
原核生物和真核生物 DNA 复制异同点 相同点： 1、分为起始、延伸、终止三个过程； 2、必须有提供3'羟基末端的一小段 RNA 引物； 3.亲代 DNA 分子为模板，四种脱氧三磷酸核苷（ dNTP ）为底物，需要 ATP 和无机离子，多种酶及蛋白质；DNA 拓扑异构酶、 DNA 解链酶、 单链结合蛋白、引物酶、DNA 聚合酶、 RNA 酶以及 DNA 连接酶等。 4、一般为双向复制、半保留复制、半不连续复制，有复制的起始点与方向，都需要 DNA pol 。 不同点： （1）真核生物中复制进行的速度约为50个核苷酸／秒，仅为原核生物的1/10，但真核生物染色体上 DNA 复制起始点有多个，因此可以从几个起始点上同时进行复制。（速度慢，多起点） (2）真核生物 DNA 复制过程中的引物及冈崎片段的长度均小于原核生物。真核长约100-200个核苷 酸，原核长约1000-2000个。 (3）原核生物 DNA 复制由 DNA - pol III催化， NAD ＋供能；真核生物 DNA Pol α 及 DNA Polδ在细胞核内 DNA 的复制中起主要作用。DNAPolδ催化前导链及随从链的合成， ATP 供能； DNA Pol α 与引物酶共同催化引发链的合成。 DNA Polδ有3'-5'外切酶活性，因此有校正的功能。 DNA Pol γ是线粒体中的复制酶。 (4）真核生物切除引物除了 RNA 酶外，还要核酸内切酶。 (5）原核生物基因为环状 DNA ，复制终止点 ter ,催化填补空隙为 DNA - pol l , DNA 连接酶连接冈崎片段成 DNA 链；真核生物基因为线状 DNA ,复制与核小体的装配同步进行，复制后形成染色体， DNA - pol ε填补空隙，存在端粒及端粒酶防止 DNA 的缩短。
PCR 原理 聚合酶链式反应( Polymerase Chain Reaction , PCR ）是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的 分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制， PCR 的最大特点是能将微量的 DNA 大幅增加 PCR 是利用 DNA 在体外摄氏95℃高温时变性会变成单链，低温（经常是60℃左右）时引物与单 链按碱基互补配对的原则结 ，再调温度至 DNA 聚合酶最适反应温度（72℃左右）, DNA 聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3）的方向合成互补链。 基于聚合酶制造的 PCR 仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
脱氧核糖核苷三磷酸的缩写。是包括 dATP , dGTP , dTTP , dCTP 等在内的统称， N 是指含氮碱基，代表变量指代 A 、T、 G 、 C 等中的一种。
什么是实时荧光定量 PCR ? ● qPCR ( quantitative PCR )，利用荧光信号的变化实时检测 PCR 扩增中每一个循环扩增产物量的变化，并进行定量分析。 ●常规 PCR ：对 PCR 扩增的终产物进行定量和定性分析，无法对扩增反应实时监控。 扩增曲线：实时检测信号变化
如何实现实时监控？ ●在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用 PCR 扩增中荧光信号的变化实时监控核酸扩增 信号检测器——— qPCR 仪 染料法 TaqMan 探针法 化学原理：荧光报告分子是检测的基础
荧光定量 PCR 的化学原理 SYBR Green I 染料法 SYBR Green I 是一种可以非特异地结合双链 DNA 小沟的荧光染料，它嵌合进DNA 双链（ dsDNA )，但不结合单链。 结合 dsDNA 的 SYBR Green ,发射强荧光信号 游离 SYBR Green 产生很少荧光
数量关系 1、每形成一个 DNA 双链，就有一定数量的染料结合上去： 2、染料一结合，就产生荧光信号； 3、信号强度与 DNA 分子总数目成正比。
重点右列 温度 时间 必考 计算时间
如何实现实时监控？ ●在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用 PCR 扩增中荧光信号的变化实时监控核酸扩增 ●信号检测器 qPCR 仪器 荧光激发 信号采集装置 光信号转化为数字信息 仪器的原理就是，仪器会发生光，透过滤光片照射 到 PCR 反应板上，反应体系产生的荧光会再次通过滤光片被仪器所接到，在经过信号转换就得到了我们常见的数字信息。
Ex <100%: ●试剂性能不达标，包括Mg2＋浓度偏低、引物浓度偏低、探针降解等。 ●梯度稀释错误，包括稀释方式错误、稀释后样本降解等。 ●样本中存在抑制物，导致酶活性下降，扩增效率降低。 ●模板匹配度差（错配），主要包括突变的存在，导致探针结合效率下降。 Ex >100%: ●梯度稀释错误。 ●出现非特异性扩增。 n :扩增反应的循环次数 X ：第 n 次循环后的产物量 X₀：起始模板量 Ex :扩增效率
如何去理解数字信息？ PCR 动力学曲线和四个阶段 对数图谱 基线期 指数增长期 线性增长期 平台期 线性图谱
定量 PCR 扩增曲线的各种概念 基线是扩增曲线的水平部分。 阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，自动阀值一般是基线（背景）荧光信号的 标准偏差的10倍；手工阈值一般是指数增长区的中间。 Ct 值是阈值线与扩增曲线的交点在 X 轴上的值。 阈值一般是基线的标准偏差的10倍，为什么不是5倍，因为为了和基线拉开距离，证明PCR进入指数扩增期。为什么不是20倍，因为会放大误差
为什么关注 Ct 值？ Ct 值的特点： ●定量范围宽 ●极具重现性
通过 Ct 值进行样本初始模板量的定量一般包括绝对定量和相对定量两种分析方法。 相对定量就是公式法
通过熔解曲线检查产物特异性 Tm 值： DNA 的双螺旋结构打开一半时的温度。
区别 熔解曲线为正确写法，表格中错误。
实验必考 实验一 三个溶剂的原理 可能考
PAPD特点： ①无需专门设计 RAPD 扩增反应引物， ，也无须预先知道被研究生物基因组的核苷酸序列，引物可随机合成和随机选定，长度一般为9-10个核苷酸； ②每个 RAPD 反应中，仅加单个引物，就可通过引物和模板 DNA 随机配对实现扩增，扩增无特异性； 3.退火温度低，一般为36℃，这样的温度能保证核苷酸引物与模板的稳定结合，同时允许适当的错 误配对，以扩大引物在基因组 DNA 中配对的随机性，使 RAPD 有较高的检出率； ④ RAPD 技术简便易行、省时省力，不需要 RFLP 分析的预备性工作：如克隆的制备、同位素标记、 Southern 印记反应及分子杂交。 RAPD 易于程序化，利用一套随机引物可得到大量的分子标记，并 可借助于计算机系统进行分机： 5 RAPD 分析所需的 DNA 样品量极少， 仅为 RFLP 的1/1000-1/200，这对于生物早期取样鉴定或在DNA 受限制的 下是十分有利的 ⑥标记数量多，可以覆盖基因组中所有位点。 ⑦引物没有严格的种属界限，具有广泛性、通用性。
缺点： RAPD 是显性标记，不能区分生物个体基因组是杂合型还是纯合型，它提供的遗传信息不够完整。 对反应条件极其敏感，稍有改变就会影响扩增产物的重现，对设备、实验条件及操作的要求都很严格，如果达不到要求，实验的稳定性和重复性就很难保证。
DNA 突变 虽然 DNA 聚合酶的校对功能和 DNA 的修复机制十分有效，但复制产生的一些差错仍可能会漏校，以及 DNA 的一些损伤仍可能未被修复，结果它们就会遗传下去。 DNA 的这种永久性的改变叫做突变（ mutation )。 点突变：由单一碱基的改变产生的突变。广义点突变可以是碱基替换，单碱基插入或碱基缺失；狭义点突变也称作单碱基替换（ base substitution )。碱基替换又分为转换（ transitions ）和颠换（ transversions ）两类。 转换：嘌呤和嘌呤，嘧啶和嘧啶之间的替换。 颠换：嘌呤和嘧啶之间的替换。
转座子的发现 在色素合成相关基因的附近有一个解离因子（ Ds , Dissociation )，它能够影响色素合成基因 C ( Color gene ）的表达。
转座作用的机制 一个转座子由基因组的一个位置移动到另一个位置的过程称为转座。促进转座的酶称转座酶。转座子常常编码它自己的转座酶，并且每次移动时携带转座必需的基因一起在基因组内跃迁
简单转座子和复合转座子 1、两端都有20-40bp的反向重复序列 inverted repettive sequence , IR ); 2、具有编码转座酶的基因，这种酶催化转座子插入新的位置。 简单转座子 ●最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（ insertion sequence , IS )，它们是细菌染色体或质粒 DNA 的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个 IS 序列。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。 IS 序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。 ●复合式转座子（ composite transposon ）是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的 IS 序列，表明 IS 序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子， IS 序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。
转座作用的遗传效应 ①转座引起插入突变； ②转座产生新的基因： ③转座产生的染色体畸变； ④转座引起的生物进化。
真核生物中的转座子 ●在1989年， David Finnegan 首次将 TE 划分为两类： ● Class I ：反转座子；以 RNA 为中介，并且将 RNA 逆转录为 DNA ，以此整合到宿主基因组中，也就是我们常说的复制粘贴机制。 根据是否含有长末端重复序列（ long terminal repeat , LTR ）可分为 LTR ﹣反转座子和非 LTR ﹣反转座子。 反转座子不仅可以在世代中纵向传递，也可在物种间进行水平转移，或者逆转录错误，从而产生高度异质性。 ● Class ll : DNA 转座子；大多数是以剪切粘贴机制进行转座，不涉及 RNA 中介。 ●转座子是基因组的重要组成部分，可能起源于病毒或逆转录病毒退化。
RNA
第一节 RNA 的结构与种类 核糖核酸（缩写为 RNA ，即 Ribonucleic Acid )，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。 RNA 由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。 RNA 的碱基主要有4种，即 A （腺嘌呤）、 G （鸟嘌呤）、 C （胞嘧啶）、 U （尿嘧啶），其中， U （尿嘧啶）取代了 DNA 中的 T 。核糖核酸在体内的作用主要是引导蛋白质的合成。
重点
二、不同种类 RNA 分子的结构及功能 与 DNA 相比， RNA 种类繁多，分子量较小，含量变化大。 RNA 可根据结构和功能的不同分为信使 RNA ( mRNA ）和非编码 RNA ( nc RNA )。非编码 RNA 分为非编码大 RNA 和非编码小 RNA 。非编码大 RNA 包括核糖体 RNA ( rRNA )、长链非编码 RNA ( lnc RNA )。非编码小 RNA 包括转移 RNA ( tRNA )、核酶、小分子 RNA ( sRNA ）等。小分子 RNA (20~300nt）包括 miRNA 、 SiRNA 、 piRNA 、 scRNA 、 snRNA 、 snoRNA 等，细菌也有小分子 RNA (50~500nt)。 1、信使 RNA ( mRNA ) 2、核糖体 RNA ( rRNA ) 3、转运 RNA ( tRNA ) 这三大类 RNA 结构与功能均不一样，原核与真核的 RNA 也不一样。
1、信使 RNA 信使 RNA ( mRNA )：是由 DNA 的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。 最早发现于1960年，具有以下特点。 1．含量低，占细胞总 RNA 的1%~5%。 2．种类多，可达105种。不同基因表达不同的 mRNA 。 3．寿命短，不同 mRNA 指导合成不同的蛋白质，完成使命后即被降解。细菌 mRNA 的平均半衰期约为1.5分钟。脊椎动物 mRNA 的半衰期差异极大，平均约为3小时。 4．长度差异大，哺乳动物 mRNA 长度为5x10²-1* 10⁵nt原核生物与真核生物的 mRNA 虽然在结构上有差异，但功能一样，都是指导蛋白质合成的模板。 功能： 把 DNA 模板链上的碱基序列，转录为 RNA 分子上的碱基序列（ mRNA )，再从mRNA 上的碱基序列通过合成蛋白质的机构，获得氨基酸的序列。 mRNA 的碱基序列从起始密码到终止密码，以3个碱基为一组而读码，3个一组的碱基成为密码子（ codon )，每个密码子对应一个氨基酸或终止信号。
原核生物 mRNA 的特征 1.半衰期短 原核生物 mRNA 半衰期很短，一般为几分钟；真核生物 mRNA 的半衰期较长，有的可达数日。 2）以多顺反子的形式存在： 多顺反子：可以同时编码不同的蛋白质的 mRNA 。 3)5'端具有 SD （一般为 AGGA ）序列： 原核生物 mRNA 无5'端帽子结构和3'端聚腺苷酸尾巴； 真核生物 mRNA 由5'端帽子结构、5'端非翻译区（ UTR )、翻译区、3'端非翻译区（ UTR ）和3'端聚腺苷酸尾巴（ poly A ）组成。 4）原核生物 mRNA 的转录与翻译一般是偶联的； 真核生物转录的 mRNA 前体则需经转录后加工，加工为成熟的 mRNA 与蛋白质结合生成信息体后才开始工作。
真核生物 mRNA 的特征 1）真核生物 mRNA 一般为单顺反子 单顺反子：仅能编码单一蛋白质的 mRNA 。 2）真核生物 mRNA 的5'端存在帽子结构 帽子结构的功能：使 mRNA 免遭核酸酶的破坏；使 mRNA 能与核糖体小亚基结合并开始合成蛋白质；被蛋白质合成的起始因子所识别，从而促进蛋白质合 3）绝大多数真核生物 mRNA 具有 poly ( A ）尾巴 poly ( A ）尾巴的功能：它是 mRNA 由细胞核进入细胞质所必需的形式，大大提高了 mRNA 在细胞质中的稳定性。
2．核糖体 RNA ( rRNA ) 是组成核糖体的主要成分，而核糖体是合成蛋白质的场所，其是由大小两个亚基组成的，两个亚基都由 rRNA 和核糖体蛋白构成。大小一般由沉降系数表示。 特点： (1）含量高 rRNA 是细胞内含量最高的 RNA ，占细胞总 RNA 的80%~85%。 (2）寿命长，rRNA 更新慢，寿命长。 (3）种类少， 原核生物有5S、16S、23s三种 rRNA ，约占核糖体质量的66%（其中5S,23SrRNA占核糖体大亚基的70%,16S rRNA 占核糖体小亚基的60%)；真核生物主要有5S、5.8S、18S、28S四种 rRNA ，另有少量线粒体 rRNA 、叶绿体 rRNA 。大肠杆菌16SrRNA的3'端有一段保守序列 ACCUCCU ，可与 mRNA 中的 SD 序列互补结合。5 SrRNA 有两段保守序列 也已被鉴足： ① CGAAC ，可以与 tRNA 的 TψC环的 GTCG 互补结合。 2) GCGCCGAAUGGUAGU ，可以与23SrRNA中的一段序列互补结合。
3．转运 RNA ( tRNA ) 转运 RNA ( Transfer RNA )，又称传送核糖核酸、转移核糖核酸，通常简称为 tRNA ,是一种由76-90个核苷酸所组成的 RNA ，其3'端可以在氨酰﹣ tRNA 合成酶催化之下，接附特定种类的氨基酸。转译的过程中， tRNA 可借由自身的反密码子识别 mRNA 上的密码子，将该密码子对应的氨基酸转运至核糖体合成中的多肽链上。每个 RNA 分子理论上只能与一种氨基酸接附，但是遗传密码有简并性（ degeneracy )，使得有多于一个以上的 tRNA 可以跟一种氨基酸接附。 1) tRNA 功能 主要是携带氨基酸进入核糖体，在 mRNA 指导下合成蛋白质。即以 mRNA 为模板，将其中具有密码意义的核苷酸顺序翻译成蛋白质中的氨基酸顺序（见蛋白质的生物合成、核糖体）。 tRNA 与 mRNA 是通过反密码子与密码子相互作用而发生关系的。在肽链生成过程中，第一个进入核糖体与 mRNA 起始密码子结合的 tRNA 叫起始 tRNA ,其余 RNA 参与肽链延伸，称为延伸 tRNA ,按照 mRNA 上密码的排列，携带特定氨基酸的 tRNA 依次进入核糖体。形成肽链后， tRNA 即从核糖体释放出来。整个过程叫放 tRNA 循环，一般反密码子中的稀有核苷酸因配对不严格而能识别多种密码子，这种现象在生物学中称为“摆动性”。
真核生物与原核生物 mRNA 转录的主要区 市 1、存在形式不同 原核生物 mRNA 常以多顺反子的形式存在。真核生物 mRNA 一般以单顺反子的形式存在。 2、工作形式不同 原核生物 mRNA 的转录与翻译一般是偶联的。 真核生物转录的 mRNA 前体则需经转录后加工，加工为成熟的 mRNA 与蛋白质结合，生成信息体后才开始工作。 3、结构特点不同 原核生物 mRNA 无5'端帽子结构和3'端聚腺苷酸尾巴。 真核生物 mRNA 由5'端帽子结构、5端'非翻译区、翻译区、3'端非翻译区和3'端聚腺苷酸尾巴组成。
非混合型密码族：第一、二碱基相同，第三个碱基不同，但编码同一种氨基酸 混合型密码族：第一、二碱基相同，第三个碱基不同，编码不同种氨基酸 起始密码子： AUG 或 GUG 终止密码子： UAA , UGA , UAG ,不能与 tRNA 反密码子配对，但能被终止因子RF1和RF2识别，终止肽链合成。
三、遗传密码的性质 （一）简并性 由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象，称为简并性。对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子。 （二）普遍性与特殊性 （三）摆动性 密码子与反密码子配对，有时会出现不遵从碱基配对规律的情祝，称为遗传密码的摆动现象。这一现象见于密码子的第三位碱基对反密码子的第一位碱基，二者虽不严格互补，也能相互辨认。 tRNA 分子组成的特点是有较多稀有碱基，其中次黄嘌呤（ inosine , I ）常出现于反密码子第一位，也是最常见的摆动现象。
四、遗传密码的突变 （一）无义突变与错义突变 肽链终止密码子改变为有义密码或者有义密码改变为终止密码子，便称为无义突变（ nonsense mutation ) 引起编码一种特异氨基酸的密码子成为编码另一种氨基酸的密码子的改变称为错义突变（ missense mutation )。 温度敏感型突变：高温下，多肽链不能折叠成正常的构象，因而失去活性。 显现突变型性状的温度称为限制性温度，而保持原来正常性状的温度则称为许可温度。 （二）移码突变 密码子中插入或者缺失一个或者几个碱基对，从而改变阅读框的突变称为移码突变
第一节蛋白质合成的概述
一、蛋白质合成的主要组件
蛋白质的合成场所是核糖体，tRNA按mRNA模板的要求将相应的氨基酸搬运到核糖体上，氨基酸之间以肽键连接，生成具有一定排列顺序的蛋白质。蛋白质合成的原料是氨基酸，反应所需能量由ATP和GTP提供。
—、蛋白质合成的主要组件·蛋白质的合成元件有mRNA,tRNA和核糖体。1、核糖体的构成
结合点包括氨基酸臂，DHU环和反密码子环
2、原核生物核糖体的功能部位 核糖体上具有一系列与蛋白质合成有关的结合位点与傕化位点: (1）与mRNA结合的位点:蛋白质的起始合成首先需要mRNA与小亚基结合。原核生物中，核糖体与mRA的结合位点位于16S rRMA的3'端，其准确识别的基础是细菌mRNA有一段特殊的Shine-Dalgarno序列(SD序列)﹐位于起始密码子上游5~10bp处。SD序列能与核糖体小亚基16S rRA的3'端序列互补结合。真核生物没有SD序列，核糖体小·亚基准确识别mRNA的基础主要依赖于mRNA 5'端的甲基化帽子结构。 (2）A位点:与新掺入的氨酰-tRNA结合的位点一氨酰基位点，在50S亚基上。 (3)F位点:与延伸中的肽酰-tRNA结合的位点一肽酰基位点。 (4）E位点:脱氨酰tRNA的离开A位点到完全释放的一个位点。 (5)与肽酰tRIA从A位点转移到p位点有关的转移酶(即延伸因子EF-G〉的结合位点。 ( 6 ）肽酰转移酶的催化位点。
二、氨基酸的活化
二、氨基酸的活化 (一)氨基酸的活化过程 在蛋白质生物合成中，各种氨基酸在参入肽链之前必须先经活化，然后再由其特异的tRNA携带至核糖体上，才能以mRNA为模板缩合成肽链。氨基酸活化后与相应的tRNA结合的反应，均是由特异的氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl tRNA synthetase，简写为aaRS)催化完成的。 氨基酸活化:AA+ATP+酶(E)→E—AA一AMP+PPi
氨酰基转移:E-AA-AMP+tRNA→AA一tRNA+AMR+E
三、蛋白质合成的相关因子
三、蛋白质合成的相关因子 (一）原核生物可溶性蛋白因子 1、起始因子(initiation factor，IF)需要先形成核糖体·mRNA·起始tRNA三元复合物 IF-1: 1．结合到30s亚基的A位点上 2．阻止氨酰tRNA与A位结合， 3．阻止30s亚基和50s亚基结合。 IF-2: 1．使fMet-tRNA特异的结合到P位点上 2．与GTP结合为70S亚基的形成提供能量 IF-3: 1．使30S亚基与mRNA的特异位点结合 2．能保持30s亚基的稳定性，阻止30s亚基和50s亚基结合
2、延伸因子(elongation factor，EF) 原核延伸因子是原核细胞进行翻译时所需要的两种延伸因子，分别命名为EF-T和EF-G。原核延伸因子的化学本质都是蛋白质，它们的作用如下: EF-T由EF-Tu和EF-Ts组成，当EF-T与GTP结合后可使EF-Ts与EF-Tu分离。 EF-Tu (elongation factor thermo unstable，热不稳定延伸因子)介导氨基酰-tRNA进入核糖体空出的A位。“进位”过程需消耗EF-Tu水解其复合的GTP产生的能量来完成。专一识别和结合除fMet-tRNAfMet（上标）以外所有AA-tRNA，形成E-Tu ·GTP ·AA-tRNA复合物。 EF-Ts (elongation factor thermo stable，热稳定延伸因子）是EF-Tu的鸟苷酸交换因子，能催化与EF-Tu复合的GDP转化为GTP并重新形成EF-Tu和EF-Ts的二聚体(EF-T) 。 EF-G (elongation factor G，延伸因子G）具有转位酶活性，由水解GTP供能，使核糖体沿mRNA向下移动一个密码子，催化核糖体A位中的肽酰-tRNA进入P位，使A位再次空出。
3、终止因子(release factor，RF) 蛋白合成时，当核糖体移动到终止密码子时，没有相应的氨酰tRNA进入A位，而一种蛋白因子可进入，促使多肽的释放和核糖体的解离，此蛋白称终止因子。也即释放因子(release factor)。提供转录信号的DNA序列称为终止子，协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（蛋白质）则称为终止因子(termination factor)。 三种终止因子:RF1、RF2和RF3。RF3与GTP(或GDP)能结合，RF1和RF2均具有识别mRNA链上终止密码子的作用，使肽链释放。RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA和UGA。RF与F在核糖体上的结合部位是同一处。
第二节原核生物的蛋白质合成 一、肽链合成的起始 (1）核糖体30S小亚基附着于mRNA起始信号部位:SD序列正好与30S小亚基中的16s rRNA3'端一部分序列互补，因此SD序列也叫做核糖体结合序列，这种互补就意味着核糖体能选择mRNA上AUG的正确位置来起始肽链的合成，该结合反应由起始因子3(IF-3）介导，另外IF-1促进IF-3与小亚基的结合，故先形成IF3-30S亚基-mRNA三元复合物。 (2)30S前起始复合物的形成:在IF2作用下，fMet-tRNAfmet（上标）与mRNA分子中的AUG相结合，即密码子与反密码子配对，同时IF3从三元复合物中脱落，形成30S前起始复合物，即IF2-30S亚基-mRNA-fMet-tRNAfmet（上标）复合物，此步需要GTP和Mg2+参与。 (3）70S起始复合物的形成:50S亚基上述的30S前起始复合物结合，同时IF2脱落，形成70S起始复合物，即30S亚基-mRNA-50S亚基-mRNA-fMet-tRNAfmet（上标）复合物。此时fMet-tRNAfmet（上标）占据着50S亚基的肽酰位(P位)。而A位则空着有待于对应mRNA中第二个密码的相应氨基酰tRNA进入，从而进入延长阶段.
二、肽链合成的延伸 (一)延伸的AA一tRNA进入核糖体的A位点 二肽酰-tRNA2（下标）从A位进入P位，去氨酰-tRNA被挤入E位，mRNA上的第三位密码子则对应于A位。
重点背诵
延伸因子的功能 第二个AA-tRNA在延伸因子EF-Tu及GTP的作用下，生成AA-tRNA/EF-Tu/GTP复合物，然后结合到核糖体的A位。 (只有fMet-tRNAfmet（上标）能与第一个P位点结合，其他的tRNA必须通过A位点到P位点)
肽链终止 出现终止密码子在核糖体的A位点时 释放因子结合密码子 水解P位上多肽链与tRNA间的二酯键,多肽链释放大小亚基解离,蛋白质合成结束
四、原核生物蛋白质合成的抑制剂 1、链霉素、卡那霉素、新霉素等: 这类抗生素属于基甙类，它们主要抑制革兰氏阴性细菌蛋白质合成的三个阶段:①S起始复合物的形成，使氨基酰tRNA从复合物中脱落;②在肽链延伸阶段，使氨基酰tRNA与mRNA错配;⑧在终止阶段，阻碍终止因子与核蛋白体结合，使已合成的多肽链无法释放，而且还抑制70S核糖体的解离。 2、四环素和土霉素: ①作用于细菌内30S小亚基，抑制起始复合物的形成，②抑制氨酰tRNA进入核糖体的A位，阻滞肽链的延伸;③影响终止因子与核糖体的结合，使已合成的多肽链不能脱落离核糖体。四环素类抗生素除对菌体70S核糖体有抑制作用外，对人体细胞的80s核糖体也有抑制作用，但对70S核糖体的敏感性更高，故对细菌蛋白质合成抑制作用更强。
(三）肽键的形成和肽酰-tRNA从A移到P点 2、肽键形成 是由转肽酶/肽基转移酶催化 A位上的AA一tRNA转移到P位，与P位的fMet-tRNAfmet（上标）上的氨基酸形成肽键，起始tRNA在完成使命后离开核糖体P位点
三、肽链合成的终止 释放因子 释放因子 I类能识别终止密码子，催化多肽链的解放 lI类刺激l类从核糖体解离 原核生物的释放因子 I类RFI识别UAG和UAA;RF2识别UGA和UAA ll类RF3与核糖体的解离有关，能刺激RF1和RF2活性 真核生物的释放因子 l类:eRF1能识别UAG UAA和UGA ll类: eRF3
真核生物翻译起始特点 核蛋白体为80S (40S + 60S) 起始tRNA携带的甲硫氨酸不需要甲酰化 mRNA5`端帽子结构与其在核蛋白体上就位有关，需要帽子结合蛋白复合物(eIF-4F)参与. eIF2与Met-tRNA(i是下标，fmet（上标）)和GTP结合构成复合体后先与40S小亚基结合，然后才与mRNA结合
二、肽链合成的延伸 (1）进位:AA-tRNA进入A位。 (2）肽链形成:AA-tRNA进位后，立即形成肽键。 (3）移位:肽键形成后，核糖体沿mRNA向3'方向移动一个密码子的距离。
肽链的延伸 核糖体沿mRNA5′ 端向3′ 端移动，开始了从N端向C端的多肽合成，这是蛋白质合成过程中速度最快的阶段。
第四节蛋白质的加工与修饰 一、蛋白质的折叠 ·蛋白质折叠的双重意义: ·结构上:使得伸展的肽链成为特定的三级结构﹔ ·功能上:使无活性的分子成为具有特定生物学功能的蛋白质分子。 ·(一)折叠过程是动力学驱动过程 ·(二)折叠过程是个动态过程 ·(三)蛋白质分子的结构域与折叠
(四）蛋白质折叠和分子伴侣 体内折叠率高的主要原因是至少有两类蛋白质(酶)的参 与，使错误折叠和聚集作用大大降低。第一类是酶，第二类是分子伴侣。 分子伴侣:是一类协助细胞内分子组装和协助蛋白质折叠的蛋白质。包括热休克蛋白Hsp60和Hsp70两个家族。 1、Hsp70在蛋白折叠中的作用 C端有一个与非折叠肽链结合的部位，通过结合新生肽链很短的一个疏水片段使新生肽链不发生错误的折叠和聚集，或不与其他蛋白质结合。C端还有ATP酶活性，当其释放新生肽链时伴有ATP水解供能。 2、Hsp70和Hsp60在蛋白折叠中的作用 Hsp60专门捕捉从Hsp70上释放的未折叠的肽链，并促使其完成折叠。
第五节 蛋白质转运机制 蛋白质穿越过生物膜而进入某种细胞器的过程被称为蛋白质转运。 ·一、翻i译-转运同步机制 ·(一）新生肽进入内质网 信号肽将蛋白质导向内质网，继而运向高尔基体、溶酶体、囊泡、质膜及分泌到细胞外。
信号肽:在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域，该氨基酸序列就被称为信号肽序列，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。 (二）蛋白质在内质网的滞留 不具有正确空间构象的蛋白质，肽链无法通过内质网，常常会被重链结合蛋白Bip结合，先被滞留然后进一步被降解。
· (三)蛋白质在内质网内的加工 ·新生肽链在内质网中翻译的同时也进行一系列加工修饰，包括信号肽 的切除、二硫键的形成、高级结构的折叠及核心糖化等。所以内质网中有多种分子伴侣、二硫键异构酶、肽基脯氨酰异构酶等折叠相关蛋白。 ·(四）蛋白质的定位和分泌
二、翻译后转运机制 · (一）导肽 导肽特性：疏水，由非电负性氨基酸构成，中间夹有带正电荷的碱性氨基酸，缺少带负电荷的酸性氨基酸，羟基氨基酸含量高(特别是Ser)，易形成双亲(既有亲水又有疏水部分)α螺旋结构。 ·导肽将蛋白质导向细胞核、线粒体、叶绿体、及其他细胞器。 (二）线粒体中的蛋白定位 线粒体蛋白质跨膜运转:还有前导肽的蛋白质，首先由外膜上的Tom受体复合物蛋白识别与Hsp70或MSF等分子伴侣，通过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。同时需要ATP水解的能量。
第一节原核生物基因表达调控 ·一、概述 ·基因表达:从DNA到蛋白质的过程。对这个过程的调节就是基因表达调控。 ·主要的基因表达影响因素 原核生物:营养状况，环境因素 真核生物:激素水平，发育阶段
(一）细菌细胞对营养的适应 葡萄糖为主的碳源，环境条件:营养、水分、溶液浓度、温度、pH等。 (二)结构基因和调节基因 结构基因:编码蛋白质或功能RNA的基因。 调节基因:编码合成那些参与基因表达调控的RNA和蛋白质的特异DNA序列。 多顺反子mRNA:把编码多个蛋白质的mRNA称为多顺反子mRNA。 单顺反子mRNA:把只编码一个蛋白质的mRNA称为单顺反子mRNA。
(三)正调控与负调控 激活蛋白(activator):正转录调控系统中，调节基因的产物，结合启动子和RNAP后，转录进行。 阻遏蛋白(repressor):负转录调控系统中，调节基因的产物，与操纵区结合，转录受阻。 负调控(negative regulation):细胞中阻遏物阻止基因转录过程的调控机制。 正调控(positive regulation):经诱导物诱导转录的调控机制。 原核生物以负调控为主，真核生物以正调控为主。
(四）可诱导的操纵子(inducible operon)与可阻遏的操纵子(repressible operon) 操纵子:指包含结构基因、操纵基因以及启动基因的一些相邻基因组成的DNA片段，其中结构基因的表达受到操纵基因的调控。它是专门针对原核生物的，真核生物中不存在。
三、转录后水平调控 (一)RNA干扰的影响 RNA干扰(RNAi):是通过小干扰RNA(siRNA)将目的mRNA特异性降解从而使基因在转录后被沉默，无法进行表达。因此，RNAi也属于在转录后水平对基因表达的调控。 RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicerenzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用,它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物3'未端互相重叠。然后这种小的干扰RA分子( small interfering RNAs , siRNAs )掺入RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC) ，引导核酸酶降解靶RNA。
3、反义RNA的调控 ①和靶核苷酸序列形成双链区，直接阻碍其功能，如翻译的起始。 ②在靶分子的部分区域形成双链区，改变其它区域的构象以影响其功能。 由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合，即抑制了该mRNA的翻译。
第二节真核生物基因表达调控一、概述 真核生物基因表达调控的原理与原核生物基因相同部分: 与原核基因的调控一样，真核基因表达调控也有转录水平调控和转录后的调控，并且也以转录水平为最重要; ②在真核结构基因的上游和下游也存在着许多特异的调控成分，并依靠特异蛋白因子与这些调控成分的结合与否调控基因的转录。 由于真核生物与原核生物的基本生活方式不同，真核生物与原核生物染色质结构、基因结构特点不同，以及真核基因与原核基因表达的时空特点不同等，真核基因表达调控中至少有四个方面与原核基因表达调控不同:
(1）真核基因表达受到更多层次的调控，由于真核基因的转录与翻译在时空上是分别进行的，而且真核基因是断裂基因，转录后需经过剪切去除内含子拼接外显子等修饰过程才具有翻译模板活性，使得真核基因的表达有多种调控机制，包括DNA和染色体水平的调控、转录水平的调控、转录后水平的调控、翻译水平的调控、蛋白质加工水平的调控等多种层次。 (2）顺式作用元件与反式作用因子的转录调节模式，转录起始的调节是真核基因表达调控的关键环节，这一过程主要是通过顺式作用元件(cis-acting element)与反式作用因子(trans-acting factor）的相互作用而实现。 (3）正调控占主导，真核细胞中虽然也像原核生物一样有正调控和负调控成分，但目前已知的主要是正调控，而且一个真核基因通常有多个调控序列，必须有多个激活物同时特异的与之结合才能调节基因的转录。 (4）细胞特异性表达，真核生物都为多细胞生物，在个体发育过程中发生细胞分化后，不同细胞的功能不同，基因表达的情况也不一样，某些基因仅特异地在某种细胞表达，称为细胞特异性或组织特异性表达。真核生物的细胞特异性或组织特异性表达显示其具有调控这种特异性表达的机制。
·(五)DNA甲基化与去甲基化 ·甲基化作用通过两种方式抑制转录: ·一是通过干扰转录因子对DNA结合位点的识别。 ·二是将转录因子识别的DNA序列转换为转录抑制物的结合点。
三、转录水平(一）顺式作用元件 影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。其活性仅影响与其自身处于同一分子的基因。 真核基因的顺式作用元件按其功能可以分为启动子、增强子、沉默子、绝缘子、应答原件。 (1）启动子 在DNA分子中，RNA聚合酶能够识别、并导致转录起始的序列。 真核基因的启动子指的是RNA聚合酶(RNA polymerase，RNAPol)识别、结合的基因转录调控区中启动基因转录的一段特异DNA序列，包含一组转录调控功能组件，其中每一个功能组件的DNA序列约7-20bp。
(3)绝缘子 绝缘子(insulator):是真核生物基因组的调控元件之一，亦为一种边缘元件。功能: 为阻止临近调控元件，对它所界定基因的启动子起增强或者阻遏的作用。它对增强子的抑制作用具有极性，即只对处于其所在边界另一侧的增强子有抑制作用，而并不能抑制与其处于同一结构域的增强子。
1、转录因子的分类 按功能分为2类: 通用或基本转录因子，是RNAP结合启动子所必需的一组蛋白因子，决定3种RNA转录的类别; 特异转录因子，个别基因转录所必需的转录因子，决定该基因的时间、空间特异性表达，包括转录激活因子和抑制因子。 2、转录因子的结构 基本结构包括3个主要功能域: 识别或结合DNA的结构域 转录活性域 结合其他因子或调控蛋白的调节结构域
(二)反式作用因子 是能够直接或间接识别或结合特异性顺式元件(启动子、增强子等)序列的蛋白质。 参与调控靶基因转录效率，起正向或负向调控用。
·四、转录后水平 · (一）RNA的剪接对基因表达的影响 在DNA水平上，真核生物基因与原核生物基因有一个明显的不同之处，也就是真核生物的基因是不连续的，外显子与内含子相间排列，而转录的时候外显子和内含子是一起转录的。转录以后必须降内含子切除，才能形成成熟的mRNA分子。这个过程成为剪接(splicing)。 剪接有2种基本方式:组成型剪接(constitutive splicing),将内含子从mRNA前体中去除，然后规范地将外显子连接成熟的mRNA，每个转录单位一般只产生—种蛋白质; 选择性剪接或者可变剪接(alternative splicing)，这是多数情况下采用的剪接方式。有些基因产生的mRNA前体可按不同方式剪接产生出两种或者更多种mRNA，这种情况下一个转录单位可以产生几种不同的成熟mRNA，翻译产生不同的蛋白质，一般而言，这些蛋白质是结构相关、功能相似的蛋白质家族，即同工型蛋白。 -RNA剪接也受调控，也有正和负调控之分。
(三）翻译终止调控 1、严紧控制 当细菌发现它们自己生长在饥饿的条件下,缺乏维持蛋白质合成的氨基酸时，它们将大部分活性区域都关闭掉。此就称为严紧反应 (stringent response)，这是它们抵御不良条件，保存自己的一种机制。 2、mRNA的寿命对翻译的调节
(二)基因的现代概念 基因(gene）是能够编码蛋白质或者RNA等具有特定功能产物的/负载遗传信息的基本单位，即有遗传效应的DNA片段(可以理解为: Gene=proteintRNA [mRNA、tRNA、rRNA] ) 基因组(genome):是指一个生物体内所有遗传物质的总和，对于含有线粒体或者叶绿体等结构的生物来说，还包括其中的环状DNA（线粒体: Mitochondrial DNA;叶绿体: chloroplast DNA)，由两部分组成:编码区和调控区。