重组DNA技术的基本工具

生物高中人教版选择性必修三 ，包括分子缝合针，DNA连接酶，分子手术刀，限制性内切核酸酶，分子运输车载体，基因工程。

3.1 重组DNA技术的基本工具

• “分子手术刀” 限制性内切核酸酶
  • 简称：限制酶
  • 来源
    • 原核生物
  • 作用
    • 能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列， 并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
  • 识别序列
    • 通常由6个核苷酸组成，也有由4,8或其他数量的核苷酸组成
      • EcoR Ⅰ：-GAATTC- Sma Ⅰ：-CCCGGG-
    • 回文序列
      • 一条链正向读的碱基序列与另一条链反向读的碱基序列完全一致
  • 切割末端
    • 粘性末端
      • 当限制酶在它的识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时， 产生的是黏性末端
        • EcoR Ⅰ：AATT
    • 平末端
      • 当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时， 产生的是平末端
• “分子缝合针” DNA连接酶
  • 作用
    • 将双链DNA分子连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
  • 种类
    • E.coli DNA连接酶
      • 来源：大肠杆菌
      • 特点：只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来， 不能连接具有平末端的DNA片段
    • T4 DNA连接酶
      • 来源：T4噬菌体
      • 特点：既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端， 又可以缝合双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率较低
• “分子运输车” 载体
  • 种类
    • 质粒，噬菌体，动植物病毒等
  • 常用载体——质粒
    • 定义：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核和原核细胞拟核DNA之外， 并具有自我复制能力的环状双链DNA分子
    • 质粒作为载体所具备的条件
      • （1）稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
      • （2）有一个至多个限制酶切割位点
        • 供外源DNA片段（基因）插入其中
      • （3）有特殊的标记基因 （四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因，绿色荧光蛋白基因）
        • 便于重组DNA分子的筛选
      • （4）对受体细胞无毒害，易分离
    • 真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的
• Q:为什么限制酶不切割细菌本身的DNA的分子
  • A:(1)细菌自身的DNA分子没有该限制酶的识别序列； （2）甲基化酶对细菌自身的DNA分子进行了修饰。
• Q:限制酶存在于原核生物中的主要作用
  • A:防止外来侵害
• Q:为什么不同生物的DNA可以拼接在一起？
  • A:几乎所有的生物DNA分子都是由4种脱氧核苷酸形成的规则的双螺旋结构。
• Q：一种生物的基因可以在不同种生物体内表达的原因
  • A:(1)所有的生物共用一套遗传密码； （2）遵循中心法则； （3）基因是控制生物性状的独立遗传单位。
• 基因工程
  • 重组DNA技术
  • 操作层面
    • DNA分子水平
  • 操作原理
    • 基因重组
  • 操作环境
    • 生物体外；无菌
  • 操作对象
    • 基因
  • 操作目的
    • 按照人们的愿望， 定向地创造出更符合人们需要的生物类型和生物产品