PCR

高中生物基因工程总结 必背语言有： DNA聚合酶作用、 为什么需要引物、 用两种限制酶能够防止产生哪些后果、 标记基因的作用、 退火的目的、 1个DNAPCR扩增n次。

基因工程

• 操作程序
  • 目的基因的筛选和获取
    • 人工合成
      • 序列已知且较短
      • DNA合成仪
    • 基因文库中获取
      • 步骤
        • 基因组文库：
          • 某物种的DNA取出并酶切
            • 构建重组载体（一般：克隆载体）
              • 导入受体菌群体（各个受体菌分别含有不同基因）
        • cDNA文库：
          • 取RNA
            • 逆转录出cDNA
              • 。。。
      • 关于克隆载体
        • 含目的基因、复制原点、标记基因
    • PCR技术获取和扩增
      • 步骤
        • 90度以上变性
          • 双链DNA解聚为单链
            • 条件：高温断开氢键
              • 模板DNA中GC含量多可预变性
                • 使DNA充分变性，以利于引物更好地与模板结合
        • 50度左右复性/退火
          • 两种引物与两条单链DNA相连（不排除两条单链模板DNA重新连起来的可能）
          • 复性温度的设置是PCR成败的关键，与引物有关
            • 与引物的长短有关
            • 与引物中碱基的组成有关
              • CG越多复性温度越高
            • 设计依据：解链温度-（5-10度）
              • 复性温度过低：引物容易错配，非特异性产物增加
              • 复性温度过高：破坏引物与模板DNA的配对，扩增效率下降，甚至没有产物
        • 72度左右延伸
          • 原因：耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）的最适温度
            • 子主题
          • 目的
            • 在Taq酶的作用下，以4种游离的脱氧核苷酸为原料，从引物的3′端开始延伸，合成新的DNA链。
          • 时间
            • 最后一次延伸时间可以有所延长：
              • 使所有的子代DNA充分复制（延伸）
      • 引物的设计原则
        • 根据目的基因两端的核苷酸序列设计
        • 避免引物内部或两种引物之间碱基互补配对而失效
        • 引物长度：20-30bp
          • 太短：易产生非特异性产物
        • 引物碱基组成
          • 影响复性温度
        • 引物改造
          • 5端加限制酶识别序列（很多题目需要具体写哪种限制酶识别序列）
          • 引物中设置突变碱基，替换原来的碱基，诱导基因突变
          • 子主题
      • 种类
        • 大引物PCR
        • 重叠延伸PCR
        • 巢式PCR
        • RT-PCR
          • • 逆转录PCR
        • qPCR/Real-timePCR）
          • 实时荧光定量PCR
        • RT-qPCR
          • 实时荧光定量逆转录PCR
            • 核酸检测
        • 反义PCR
      • 子主题
    • 子主题
  • 基因表达载体的构建
  • 将目的基因导入受体细胞
  • 目的基因的检测和鉴定
• 易错点
  • 将目的基因插入载体时用到的工具酶
    • DNA连接酶和限制酶（具体写哪种限制酶）
  • 载体、基因表达载体、重组载体含义不同
  • 各种酶的作用
    • DNA聚合酶
    • 限制酶
    • Taq酶
    • RNA聚合酶
    • DNA水解酶
  • 不会写黏性末端
  • 抗生素合成基因是不是标记基因
• 必背语言
  • DNA聚合酶作用
    • 将游离的脱氧核苷酸连接到正在合成的DNA单链末端
  • 为什么需要引物
    • DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从核苷酸链的3端开始延伸DNA
  • 用两种限制酶能够防止产生哪些后果
    • 目的基因、质粒自身环化，目的基因反向连接到质粒
  • 标记基因的作用
    • 筛选出含有目的基因的受体细胞
  • 退火的目的
    • 使引物与模板DNA单链相连
  • 1个DNAPCR扩增n次
    • 需要2n+1-2个引物；等长的DNA2n-2n