DNA重组技术的基本工具
分子手术刀--限制性核酸内切酶
①≠水解酶
②主要由原核生物中分离纯化出来（原核细胞需切割外来DNA如病毒DNA以保证自身DNA的稳定/安全
③能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列
分子缝合针--DNA连接酶
E•coilDNA连接酶：大肠杆菌中分离，只连接粘性末端
T4 DNA连接酶：T4噬菌体中分离出来，两种末端都可连接
分子运输车--基因进入受体细胞的载体
机理：携带外源DNA片段的载体进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。
常用：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等
（来源不同，在大小、结构、复制以及插入片段大小上也有很大差别）
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因文库（从中获取目的基因
部分基因文库（如cDNA文库--根据需要，有大有小
PCR技术（扩增目的基因
全称：多聚酶链式反应（一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
步骤：解旋（90～95℃）---结合引物（55～60℃）---互补链合成（70～75℃）---解旋……
基因表达载体的构建
目的：
①使目的基因在受体细胞中稳定存在
②并可以遗传给下一代
③使目的基因能够表达和发挥作用
组成：目的基因、启动子（RNA聚合酶识别和结合的部位）、终止子、标记基因（如抗生素抗性基因）
将目的基因导入受体细胞
植物：
①农杆菌转化法（双子叶植物和裸子植物（自然条件下（约80%的转基因植物运用此法
②基因枪法（单子叶植物（成本较高
③花粉管通道法（经济简便
动物：
显微注射法（若目的基因为受精卵，则需经早期胚胎培养一段时间后再移植到雌性动物的输卵管或子宫内，使其发育成具有新性状的动物
微生物细胞：
（由于原核生物具有繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少等特点，早期基因工程都以它们为受体细胞）
以大肠杆菌为受体最常用：首先用钙离子处理细胞，使细胞处于一种能够吸收周围环境中，DNA分子的生理状态（感受态）；将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中，与感受态细胞混合，在一定温度下，促进感受态细胞吸收DNA分子完成转化过程
目的基因的检测与鉴定
DNA分子杂交技术（检测转基因生物的DNA是否插入了目的基因
在含有目的基因的DNA片段上，
用放射性同位素等作标记
蛋白质工程的崛起
缘由
基因工程原则上只能生产自然界已经存在的蛋白质(蛋白质工程生产自然界不存在的蛋白质)
原理
中心法则：基因→表达（转录和翻译）→形成氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能
蛋白质工程与此相反：预期的蛋白质功能→设计预期蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求
进展和前景
①已改造胰岛素使其成为速效型药品
②用蛋白质工程方法制成的电子元件，具有体积小，耗电少和效率高的特点
③目前科学家对大多数蛋白质的高级结构的了解还不够
基因工程的应用
植物
抗虫作物中的杀虫基因：BT毒蛋白基因（抗虫棉）、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因……
抗病转基因植物
采用基因：
病毒外壳蛋白，基因病毒的复制酶基因（使用最多）；几丁质酶基因、抗毒素合成基因（抗真菌
抗逆转基因植物
例：鱼的抗冻蛋白基因→烟草、番茄
抗除草剂基因→大豆、玉米……
改良植物的品质
例：转基因玉米（高赖氨酸）、转基因延熟番茄（储存时间长）、转基因矮牵牛花（颜色变异）
动物
用于转基因动物生产药物（乳腺/房生物反应器（受体为受精卵
基因治疗
例：①1990年九月，美国移民患有严重复合型免疫缺陷症的四岁女童→研究人员将腺苷酸脱氨酶基因转入取自患者的淋巴细胞中，使淋巴细胞能够产生腺苷酸脱氨酶→导入女童体内 （体外基因治疗
②1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒作载体成功将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因转入患者肺组织中（体内基因治疗
cDNA由mRNA反转录而来，不含内含子
（原核细胞中缺少切割内含子的机制）
科技探索之路（基础理论部分
•DNA是遗传物质的证明：艾弗里等人通过不同类型肺炎双球菌转化实验，不仅证明了生物的遗传物质是DNA，还证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
•DNA双螺旋结构和中心法则的确立
•遗传密码的破译（所有生物共用同一套遗传密码
如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成
一，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上，经过人工改造的
二，运载体的特点：①具有多个限制酶切位点；②能自我复制或整合到染色体DNA上随染色体复制；③有标记基因；④安全，不对受体DNA有害；⑤大小合适，便于操作
EcoRI（大肠杆菌R型菌株中分离出的第一个限制酶、SmaI识别序列为6核苷酸
（大多6，少数4、5、8
末端：平末端/粘性末端
基因工程是指按照人们的愿望进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术赋予生命以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。
