核酸体外扩增技术 基因扩增 pcr

核酸体外扩增技术 基因扩增 pcr，PCR是模拟生物体内DNA的复制过程，在体外(试管内)通过酶促反应合成特异DNA 片段的方法。

核酸体外扩增技术

• pcr技术
  • PCR原理的表述(定义)
    • PCR是模拟生物体内DNA的复制过程，在体外(试管内)通过酶促反应合成特异DNA 片段的方法。其基本原理和过程与细胞内DNA的复制相似言，由变性（denaturation）、退火 (annealing)和延伸(extension)3个步骤构成。个写性)待扩描的部DNA片段左高工其恢占
  • PCR的特点
    • 灵敏度高
    • 特异性好
    • 对模板要求低
    • 成本低，易于推广
  • 基本过程
    • 变性：高温，替代体内解旋酶(又称拓补异构酶)、解链酶
    • 退火：低温(类似复性)，引物与互补的DNA模板互补结合
    • 延申：子链与延伸DNA加倍
  • 反应体系
    • 模板，作用：提供DNA合成需要的模板
    • 引物：决定PCR扩增的特异性，决定PCR扩增的位置
      • 引物功能：降低非特异性，与模板链进行结合，提供一个3‘-OH末端
      • 位置：上游引物与5‘端相同，下游引物与3’互补
      • 引物有两个：上游引物-正义链；下游引物-反义链
      • 长度：15~30bp(过长：发夹结构，过短：降低扩增的特异性)
      • 碱基分布：同一碱基不能连续出现5个，G+C含量40%-60%，尤其是引物的 3'端避免重复的GC碱基序列(GC含量太高：非特异性结合的稳定性增加)
      • Tm值：决定退火温度，Tm=2(A+T)+4（C+G) 长度和碱基分布决定Tm值 （所以：GC含量，破基长度不能过低)
      • 末端修饰:3"端要严格配对，不能进行化学修饰，5‘端可以
    • dNTP，作用：模板链，c链合成的原材料
    • TaqDNA聚合酶
      • 作用
        • 根据模板上的碱基 选择核昔酸
        • 能在引物的3’端催化，形成3‘-5'磷酸二酯键，使c链得以延伸，合成模板链的互补链
        • T<Tm，才能保证目的片段与模板链结合。对于特异性扩增，退火温度越高越好，抑制非特异性。退火温度越高，特异性越高
      • 酶量过多不仅浪费，而且会使非特异性扩增增加
    • 缓冲液：Mg离子，作用是DNA聚合酶的激活剂
  • 扩增参数
    • 温度（降低非特异性扩增，温度很重要）
    • 时间
    • 循环次数：一般20~40个循环，目的片段在第三个循环才第一次出现。“指数期、 线性期、平台期”PCR扩增效率称S型曲线状
• 其他pcr技术
  • 多重PCR
    • 特性：检测特定基因序列的存在或缺失时，可同时进行扩增，提高PCR检测的准确性和效率
  • 逆转录PCR（RT-PCR） 特性：能对mRNA转录而来的DNA进行扩增（cDNA含有mRNA信息，无内含子)
  • 巢式PCR 优点：巢式PCR可提高反应的灵敏度和特异性（采用两对引物，两对原因：模板量较低)，适用于靶基因的质/量较低或其他原因导致常规PCR无法获得理想的扩增产物