PCR（聚合酶链式反应）

高中生物--PCR（聚合酶链式反应），内容有目的基因的筛选和获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定，一起来看。

基因工程基本操作程序

• 目的基因的筛选和获取
  • PCR（聚合酶链式反应）
    • 可检测目的基因是否插入
    • 扩增
      • 过程
        • 延伸
          • 温度上升到72℃左右，四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶作用下碱基互补配对成新的DNA链
            • 72℃为taq酶的最适温度
        • 复性
          • 温度下降到50℃左右，引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
        • 变性
          • 90℃时双链DNA解聚为单链
      • 计算
        • N₀·2ⁿ
    • 参与组分
      • 引物
        • 两种（保证DNA两条链同时被扩增）
        • 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
      • DNA母链
        • 提供DNA复制的模板
      • 四种脱氧核苷酸
        • dntp
        • 合成DNA子链的原料
      • DNA聚合酶
        • 耐高温
        • 催化合成DNA子链
      • 解旋酶
        • 体外用高温替代
        • 打开DNA双链。
    • 条件
      • 那个温的DNA聚合酶。
        • e.g.Taq酶，KOD酶
      • 温控设备控制温度
        • PCR扩增仪
      • 稳定的缓冲溶液
        • 一般要添加Mg⁺
      • 四种脱氧核苷酸
      • DNA模板
      • 两种引物
    • 前提
      • 一段已知目的基因的核苷酸序列
        • 根据它合成引物
    • 原理
      • DNA半保留复制
    • 鉴定
      • 琼脂糖凝胶电泳
• 基因表达载体的构建
  • 基因表达载体构建
    • 标记基因
      • 作为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
    • 启动子（上游）
      • RNA聚合酶识别和结合的部位
    • 终止子（下游）
      • 终止子，启动子都非密码子
    • 限制酶切割位点
    • 目的基因
• 将目的基因导入受体细胞
  • 基因重组
  • 方法
    • 植物细胞
      • 方法
        • 农杆菌转化法
          • 利用Ti质粒上的可转移DNA：T-DNA
        • 花粉管通道法
      • 受体细胞
        • 体细胞或受精卵
    • 微生物
      • 方法
        • Ca²⁺处理法
      • 受体细胞
        • 原核细胞
    • 动物细胞
      • 方法
        • 显微注射法
      • 受体细胞
        • 受精卵
• 目的基因的检测与鉴定
  • 目的基因
• 基因探针
  • 一段带放射性标记的，与目的基因互补的特异核苷酸序列，可以是DNA，也可以是由之转录来的RNA。
• 分子杂交技术
• 真核细胞基因结构
  • 编码区
    • 外显子
    • 内含子
  • 非编码区
    • 有调控遗传信息表达作用
    • 不编码蛋白质
    • 上游启动子，下游有终止子
• 引物=保护碱基+酶切位点+目的基因序列
• 核心步骤：基因表达载体的构建
• 抗虫抗病接种实验
• 抗原-抗体杂交
• 个体
• 蛋白质
  • 充当抗原
• mRNA
• 使用仪器：Pcr扩增仪
• 引物设计要求
  • 引物自身及引物之间不应存在互补序列
  • 引物碱基20~30个
  • 两种引物长度不一定一样
  • 引物跟5’端一样
  • C或G含量约50%
  • 温度差≤5℃。
  • 子主题
  • 子主题

基因工程基本操作程序

• 目的基因的筛选和获取
  • PCR（聚合酶链式反应）
    • 可检测目的基因是否插入
    • 扩增
      • 过程
        • 延伸
          • 温度上升到72℃左右，四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶作用下碱基互补配对成新的DNA链
            • 72℃为taq酶的最适温度
        • 复性
          • 温度下降到50℃左右，引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
        • 变性
          • 90℃时双链DNA解聚为单链
      • 计算
        • N₀·2ⁿ
    • 参与组分
      • 引物
        • 两种（保证DNA两条链同时被扩增）
        • 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
      • DNA母链
        • 提供DNA复制的模板
      • 四种脱氧核苷酸
        • dntp
        • 合成DNA子链的原料
      • DNA聚合酶
        • 耐高温
        • 催化合成DNA子链
      • 解旋酶
        • 体外用高温替代
        • 打开DNA双链。
    • 条件
      • 那个温的DNA聚合酶。
        • e.g.Taq酶，KOD酶
      • 温控设备控制温度
        • PCR扩增仪
      • 稳定的缓冲溶液
        • 一般要添加Mg⁺
      • 四种脱氧核苷酸
      • DNA模板
      • 两种引物
    • 前提
      • 一段已知目的基因的核苷酸序列
        • 根据它合成引物
    • 原理
      • DNA半保留复制
    • 鉴定
      • 琼脂糖凝胶电泳
• 基因表达载体的构建
  • 基因表达载体构建
    • 标记基因
      • 作为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
    • 启动子（上游）
      • RNA聚合酶识别和结合的部位
    • 终止子（下游）
      • 终止子，启动子都非密码子
    • 限制酶切割位点
    • 目的基因
• 将目的基因导入受体细胞
  • 基因重组
  • 方法
    • 植物细胞
      • 方法
        • 农杆菌转化法
          • 利用Ti质粒上的可转移DNA：T-DNA
        • 花粉管通道法
      • 受体细胞
        • 体细胞或受精卵
    • 微生物
      • 方法
        • Ca²⁺处理法
      • 受体细胞
        • 原核细胞
    • 动物细胞
      • 方法
        • 显微注射法
      • 受体细胞
        • 受精卵
• 目的基因的检测与鉴定
  • 目的基因
• 基因探针
  • 一段带放射性标记的，与目的基因互补的特异核苷酸序列，可以是DNA，也可以是由之转录来的RNA。
• 分子杂交技术
• 真核细胞基因结构
  • 编码区
    • 外显子
    • 内含子
  • 非编码区
    • 有调控遗传信息表达作用
    • 不编码蛋白质
    • 上游启动子，下游有终止子
• 引物=保护碱基+酶切位点+目的基因序列
• 核心步骤：基因表达载体的构建
• 抗虫抗病接种实验
• 抗原-抗体杂交
• 个体
• 蛋白质
  • 充当抗原
• mRNA
• 使用仪器：Pcr扩增仪
• 引物设计要求
  • 引物自身及引物之间不应存在互补序列
  • 引物碱基20~30个
  • 两种引物长度不一定一样
  • 引物跟5’端一样
  • C或G含量约50%
  • 温度差≤5℃。
  • 子主题
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