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基因工程知识思维导图,本图分享了基因工程的技术、鉴定、应用相关知识,大家可以学起来哦。
编辑于2023-06-07 11:31:27基因工程知识
NO.1-技术
技术一:重组DNA技术
一:技术所需的基本工具
原理:基因重组
技术的理论基础 : 1)肺炎双链球菌转化实验证明DNA可以从一种生物转移至另一种生物 2)DNA双螺旋结构的发现 3)中心法则的建立
重组DNA技术的工具(3大类) 1)限制性内切核酸酶: 来源:主要从原核生物中分离出来(少部分从真核生物中分离) 作用:识别双链DNA分子的特定核酸序列,切割其序列中特定部位的磷酸二酯键(DNA为双链结构,故要切两个磷酸二酯键) 类别:粘性末端,平末端 2)DNA连接酶: 作用:将两个DNA片段连接起来的酶(形成磷酸二酯键) 类别:只连接粘性末端(EcoliNDA)都能连接(T4DNA) 3)载体: 作用:将目的基因安全导入受体细胞 特点:①环状双链DNA分子 ②由一个或多个限制酶切割位点 ③至少有一个标记基因 类别:①质粒(不限制受体细胞类型,但侵染性差) ②噬菌体(以细菌为受体细胞) ③动植物病毒(以动植物细胞为受体细胞)
二:重组DNA技术的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
获取方法: 1)人工合成(仅限于数量较少的DNA) 2)从基因文库中获取:①基因组文库(包含所有原核生物DNA) ②cDNA文库(包含部分真核生物DNA) 3)利用PCR获取
PCR(链式聚合酶反应)体系: 模板:目的基因的DNA序列 ②原料:dNTP(四种游离的脱氧核糖核苷酸) 引物(一小段DNA或RNA序列) ③酶:Taq酶(耐高温的DNA聚合酶) ④能量:Mg离子(激活Taq酶) dNTP B、过程(高温变性-低温复性-中温延伸) C、引物作用:使DNA聚合酶能从3’端开始连接脱氧核苷酸
基因表达载体的构建(技术核心)
1)载体必含物质:目的基因,标记基因,启动子,终止子,复制原点 2)启动子的作用:为RNA聚合酶识别与结合的部位,位于目的基因上游,为一小段DNA片段
将目的基因导入受体细胞
植物细胞方法: 花粉管通道法(适用于被子植物) 农杆菌转化法(适用于双子叶植物,裸子植物,单子叶植物中的水稻和玉米) 基因枪法(单子叶植物)
农杆菌转化法 ①转化:目的基因进入受体细胞内并在其中稳定维持并表达的过程 ②过程:农杆菌侵染植物细胞,使其体内的Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的植物细胞的染色体上
动物细胞方法:显微注射法 Ca离子/感受态处理法(使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态)
目的基因的检测与鉴定
分子水平:利用PCR监测是否导入DNA、是否出现mRNA、用相应抗体进行抗原-抗体杂交监测是否翻译成蛋白质
个体水平:通过直接对成熟个体进行实验来进行监测
技术二:蛋白质工程
原理与特点
原理:中心法则的逆转
特点:能产生自然界不存在的蛋白质
思路
从预期的蛋白质功能出发—设计预期的蛋白质结构—推测应有的氨基酸序列—找到并改变相对应有的脱氧核苷酸序列或合成新的基因—获得所需要的蛋白质
NO.2-鉴定
DNA的粗提取与鉴定
原理
利用DNA与蛋白质是否溶于酒精和NaCl进行实验
溶液
酒精(溶蛋白质)
2mol/LNaCl溶液(溶DNA)
0.14mol/LNaCl溶液(DNA析出)
二苯胺试剂(检验DNA)
步骤
取材料(哺乳动物的成熟红细胞不行)进行研磨——使细胞破裂
进行过滤,讲过滤液倒入烧杯,在4°C冰箱中放置(DNA酶在低温下活性下降,防止DNA被降解),离心后取上清液(DNA和蛋白质主要存在的地方)
在上清液中加入遇冷的酒精溶液(使DNA沉淀),再用玻璃棒沿一个方向搅拌(防止DNA断裂)
取两只试管(进行对比),各加入2mol/LNaCl溶液,将丝状物放入其中一个试管,向两个试管各加入二苯胺试剂
水浴加热,比较两个试管中的颜色,颜色变紫色的为实验组,不变的为对照组主题
有关于重组质粒的鉴定方法
方法一:利用标记基因筛选重组质粒(质粒中包含两种不同的标记基因,以四环素和氨苄青霉素为例,目的基因破坏氨苄青霉素)
受体细胞导入后所存在的四种情况(两大类三小点)
未转化:①(受体细胞中不含有任何物质)
转化: ②环状目的基因 ③空白质粒 ④重组质粒
筛选过程
在培养基中加入四环素(去除①②)
再次加入氨苄青霉素(去除④)
④则为我们所需的重组质粒
方法二:利用荧光蛋白基因筛选重组质粒
过程
将目的基因与荧光蛋白基因结合
导入受体细胞中使其表达,能产生荧光的即为所需重组质粒
DNA片段的电泳鉴定(琼脂糖凝胶电泳)
NO.3-应用
一、干扰素/胰岛素等需要活性的蛋白质的合成
通常使用真核生物而不用原核生物(通常为大肠杆菌等细菌为例) 理由是:原核生物(大肠杆菌)无内质网和高尔基体,无法对得到的蛋白质进行加工,产生出的蛋白质没有生物活性,不可使用
二、乳腺生物反应器和膀胱生物反应器
现在通常使用的是膀胱生物反应器,理由是:相比于乳腺生物反应器,不受年龄,性别的限制