基因工程知识

基因工程知识思维导图，本图分享了基因工程的技术、鉴定、应用相关知识，大家可以学起来哦。

基因工程知识

• NO.1-技术
  • 技术一：重组DNA技术
    • 一：技术所需的基本工具
      • 原理:基因重组
      • 技术的理论基础 : 1)肺炎双链球菌转化实验证明DNA可以从一种生物转移至另一种生物 2)DNA双螺旋结构的发现 3)中心法则的建立
      • 重组DNA技术的工具（3大类） 1)限制性内切核酸酶： 来源：主要从原核生物中分离出来（少部分从真核生物中分离） 作用：识别双链DNA分子的特定核酸序列，切割其序列中特定部位的磷酸二酯键（DNA为双链结构，故要切两个磷酸二酯键） 类别：粘性末端，平末端 2）DNA连接酶： 作用：将两个DNA片段连接起来的酶（形成磷酸二酯键) 类别：只连接粘性末端（EcoliNDA）都能连接（T4DNA） 3）载体： 作用：将目的基因安全导入受体细胞 特点：①环状双链DNA分子 ②由一个或多个限制酶切割位点 ③至少有一个标记基因 类别：①质粒（不限制受体细胞类型，但侵染性差） ②噬菌体（以细菌为受体细胞） ③动植物病毒（以动植物细胞为受体细胞）
    • 二：重组DNA技术的基本操作程序
      • 目的基因的筛选与获取
        • 获取方法： 1）人工合成（仅限于数量较少的DNA） 2）从基因文库中获取：①基因组文库（包含所有原核生物DNA） ②cDNA文库（包含部分真核生物DNA） 3）利用PCR获取
          • PCR（链式聚合酶反应）体系： 模板：目的基因的DNA序列 ②原料：dNTP（四种游离的脱氧核糖核苷酸） 引物（一小段DNA或RNA序列） ③酶：Taq酶（耐高温的DNA聚合酶） ④能量：Mg离子（激活Taq酶） dNTP B、过程（高温变性-低温复性-中温延伸） C、引物作用：使DNA聚合酶能从3’端开始连接脱氧核苷酸
      • 基因表达载体的构建（技术核心）
        • 1）载体必含物质：目的基因，标记基因，启动子，终止子，复制原点 2）启动子的作用：为RNA聚合酶识别与结合的部位，位于目的基因上游，为一小段DNA片段
      • 将目的基因导入受体细胞
        • 植物细胞方法: 花粉管通道法（适用于被子植物） 农杆菌转化法（适用于双子叶植物，裸子植物，单子叶植物中的水稻和玉米） 基因枪法（单子叶植物）
          • 农杆菌转化法 ①转化：目的基因进入受体细胞内并在其中稳定维持并表达的过程 ②过程：农杆菌侵染植物细胞，使其体内的Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的植物细胞的染色体上
        • 动物细胞方法：显微注射法 Ca离子/感受态处理法（使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态）
      • 目的基因的检测与鉴定
        • 分子水平：利用PCR监测是否导入DNA、是否出现mRNA、用相应抗体进行抗原-抗体杂交监测是否翻译成蛋白质
        • 个体水平：通过直接对成熟个体进行实验来进行监测
  • 技术二:蛋白质工程
    • 原理与特点
      • 原理：中心法则的逆转
      • 特点：能产生自然界不存在的蛋白质
    • 思路
      • 从预期的蛋白质功能出发—设计预期的蛋白质结构—推测应有的氨基酸序列—找到并改变相对应有的脱氧核苷酸序列或合成新的基因—获得所需要的蛋白质
• NO.2-鉴定
  • DNA的粗提取与鉴定
    • 原理
      • 利用DNA与蛋白质是否溶于酒精和NaCl进行实验
    • 溶液
      • 酒精（溶蛋白质）
      • 2mol/LNaCl溶液（溶DNA）
      • 0.14mol/LNaCl溶液（DNA析出）
      • 二苯胺试剂（检验DNA）
    • 步骤
      • 取材料（哺乳动物的成熟红细胞不行）进行研磨——使细胞破裂
      • 进行过滤，讲过滤液倒入烧杯，在4°C冰箱中放置（DNA酶在低温下活性下降，防止DNA被降解），离心后取上清液（DNA和蛋白质主要存在的地方）
      • 在上清液中加入遇冷的酒精溶液（使DNA沉淀），再用玻璃棒沿一个方向搅拌（防止DNA断裂）
      • 取两只试管（进行对比），各加入2mol/LNaCl溶液，将丝状物放入其中一个试管，向两个试管各加入二苯胺试剂
      • 水浴加热，比较两个试管中的颜色，颜色变紫色的为实验组，不变的为对照组主题
  • 有关于重组质粒的鉴定方法
    • 方法一：利用标记基因筛选重组质粒（质粒中包含两种不同的标记基因，以四环素和氨苄青霉素为例，目的基因破坏氨苄青霉素）
      • 受体细胞导入后所存在的四种情况（两大类三小点）
        • 未转化：①（受体细胞中不含有任何物质）
        • 转化： ②环状目的基因 ③空白质粒 ④重组质粒
      • 筛选过程
        • 在培养基中加入四环素（去除①②）
        • 再次加入氨苄青霉素（去除④）
        • ④则为我们所需的重组质粒
    • 方法二：利用荧光蛋白基因筛选重组质粒
      • 过程
        • 将目的基因与荧光蛋白基因结合
        • 导入受体细胞中使其表达，能产生荧光的即为所需重组质粒
  • DNA片段的电泳鉴定（琼脂糖凝胶电泳）
• NO.3-应用
  • 一、干扰素/胰岛素等需要活性的蛋白质的合成
    • 通常使用真核生物而不用原核生物（通常为大肠杆菌等细菌为例） 理由是：原核生物（大肠杆菌）无内质网和高尔基体，无法对得到的蛋白质进行加工，产生出的蛋白质没有生物活性，不可使用
  • 二、乳腺生物反应器和膀胱生物反应器
    • 现在通常使用的是膀胱生物反应器，理由是：相比于乳腺生物反应器，不受年龄，性别的限制