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蛋白质
生物化学简明教程第六版蛋白质，蛋白质的分子量（Mr）差异较大，一般在10 4 ~10 6 之间，蛋白质的功能通常取决于它的特定构想。
编辑于2023-07-21 11:12:50 河南
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- 大纲
蛋白质（protein）
分类
元素分析发现
一般含
碳50%~55%
氢6%~8%
氧20%~23%
氮15%~18%
在蛋白质中比较接近，平均为16%
每1g氮相当于6.25g蛋白质
硫0%~4%
特殊的
含微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼
分类方法
根据形状和溶解度
纤维状蛋白
细棒或纤维状
大多数不溶于水
部分如肌球蛋白和血纤蛋白原是可溶性的
球状蛋白
接近球状或椭球形
多肽链折叠紧密
水溶性较好
疏水的氨基酸侧链位于分子内部
亲水的侧链在外部暴露于水溶剂
蛋白质结构的复杂性和功能的多样性主要由球状蛋白来表现
膜蛋白
一般为近球形或椭球形
与细胞的各种膜系统结合而存在
水溶性较好的膜周边蛋白
不溶于水但能溶于去污剂溶液的膜内在蛋白
根据化学组成
简单蛋白（simple protein）
仅有肽链组成，不包含其他辅助成分
按照溶解度分类
结合蛋白（conjugated protein）
又称缀合蛋白，由简单蛋白和辅助成分组成，辅助成分称为辅基
按照辅基不同分类
蛋白质+核酸
核蛋白（nucleoprotein）
分类
核内
DNA+蛋白质
质内
RNA+蛋白质
蛋白质+糖
糖蛋白（glucoprotein）
糖基一般为短的寡糖链
作用
催化
运载
结构原料
保护
识别（生物膜上的寡糖链）
蛋白聚糖（proteoglycan）
糖基由二糖重复单位
作用
结缔组织和细胞间质的特有成分
组织细胞之间的天然黏合剂
参与细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用
蛋白质+脂质
脂蛋白（lipoprotein）
载脂蛋白
蛋白质与脂质之间通过非共价键相连
存在于血浆中
因此也称血浆脂蛋白
经血液循环运输不溶于水脂质
游离的脂肪酸与血清蛋白结合
三酰甘油、磷脂、胆固醇和胆固醇酯以更复杂的可溶性脂蛋白颗粒形式被转运
按相对密度分类
蛋白质含量高，相对密度大
乳糜微粒
极低密度脂蛋白
低密度脂蛋白
高密度脂蛋白
锚定蛋白
共价连接
生物膜中
蛋白质+色素
色蛋白（chromoprotein）
种类多，以含卟啉类的色蛋白最为重要
呼吸链中的5种细胞色素都是由蛋白质和铁卟啉组成
蛋白质+金属离子
至少三分之一的酶的催化活性需要金属离子
根据功能
酶
具催化活性的蛋白质
调节蛋白
具有调控功能
激素
转录因子和基因调节蛋白
贮存蛋白
贮存必要的养分
卵清蛋白为胚胎发育提供氮源
铁蛋白能贮存铁原子
转运蛋白
存于体液中
运输氧气、脂肪酸
膜转运蛋白
养分运输，把葡萄糖、氨基酸转运到细胞内
运动蛋白
肌肉收缩
肌球蛋白
肌动蛋白
相对滑动
细胞器移动
细胞骨架的某些蛋白
防御蛋白与毒蛋白
防御蛋白
防御与保护功能
抗体
凝血酶
抗冻蛋白
病毒外壳蛋白
毒蛋白
动物毒蛋白
溶血蛋白
神经毒蛋白
植物毒蛋白
蓖麻毒蛋白
细菌毒蛋白
白喉毒素
霍乱毒素
受体蛋白
接受和传递信息
支架蛋白
通过蛋白质—蛋白质相互作用识别并结合蛋白质中的某些结构元件将多种不同的蛋白质装配成一个复合体
结构蛋白
建造和维持生物体结构
不溶性纤维状蛋白
异常功能蛋白
某些蛋白质具有特殊功能
高甜度
高弹性
高黏度
组成
水解
酸水解
优点
不引起消旋
得到L-氨基酸
缺点
色氨酸被破环
丝氨酸和苏氨酸有一部分被水解
天冬酰胺和谷氨酰胺被水解
碱水解
优点
色氨酸稳定
缺点
多数氨基酸遭到不同程度破坏
产生消旋，得到的是L-H和D-氨基酸的混合物
酶水解
优点
不产生消旋
不破坏氨基酸
缺点
需要几种酶协同
耗时较长
氨基酸
广义上：分子中既有氨基又有羧基的化合物
结构通式
α-碳原子都为不对称碳原子
除甘氨酸外所有α-氨基酸均有旋光行
每种氨基酸都有D型和L型两种异构体
从蛋白质水解中得到的均为L-α-氨基酸
某些抗生素中存在D型氨基酸
构型与旋光方向没有直接对应关系，同一种L-α-氨基酸在不同溶剂中有不同的旋光性或旋光度
分类
常见氨基酸
分类依据
R基的化学结构
脂肪族氨基酸
芳香族氨基酸
杂环氨基酸
杂环亚氨基酸
研究氨基酸代谢途径时采用此类方法
R基的极性
非极性R基氨基酸
丙氨酸（Ala）A
缬氨酸（Val）V
亮氨酸（Leu）L
异亮氨酸（Ile）I
脂肪烃侧链
脯氨酸（Pro）P
带有独特的环状结构
甲硫氨酸（Met）M
苯丙氨酸（Phe）F
色氨酸（Trp）W
可以借助吲哚环的-NH-基团与水相互作用
芳香族氨基酸
甘氨酸（Gly）G
介于非极性和极性之间，有时也被归于极性不带电
极性不带电荷的R基氨基酸
丝氨酸（Ser）S
苏氨酸（Thr）T
酪氨酸（Tyr）T
低pH范围呈现显著的非极性特征，中性pH下，溶解性很低
高pH，酚羟基带有电荷，极性较强，溶解度会增大
羟基
天冬酰胺（Asn）A
谷氨酰胺（Gln）Q
氨基
半胱氨酸（Cys）C
巯基
R基都能与水形成氢键
极性带负电荷的R基氨基酸
天冬氨酸（Asp）D
谷氨酸（Glu）E
酸性氨基酸
中性pH行带有净负电荷，可以结合金属阳离子
许多蛋白质依赖着两种氨基酸形成一个或多个金属结合位点
极性带正电荷的R基氨基酸
组氨酸（His）H
可以作为质子供体和受体，含有组氨酸的肽具有生物学缓冲功能
咪唑基
精氨酸（Arg）R
胍基
赖氨酸（Lys）K
侧链氨基
在pH7时完全质子化
碱性氨基酸，在中性pH条件下，三种基团均可接受质子
不常见氨基酸
修饰式氨基酸
赖氨酸和脯氨酸的羧基化
酪氨酸的碘化衍生物
氨基酸的甲基化
掺入式氨基酸
半胱氨酸中的硫被硒取代而成的硒代半胱氨酸
某些氨基酸残基还可以发生可逆的共价修饰
磷酰化
甲基化
乙酰化
腺苷酰化
ADP-核糖化
等
调节蛋白质的功能
非蛋白质氨基酸和氨基酸衍生物
不参与构建蛋白质，但却具有重要作用
传递神经冲动的化学介质
组成辅酶A的重要部分——泛酸的成分之一
某些抗生素也含有氨基酸衍生物
理化性质
两性解离和等电点
两性解离
熔点高，能溶于水不溶于有机溶剂
两性离子是指在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的-NH3+正离子和能接受质子的-COO-负离子
等电点
使氨基酸分子上的-NH3+和-COO-解离度完全相同，即氨基酸所带净电荷为零，在电场中不向任何一极移动，此时溶液的pH
氨基酸的氨基和羧基连接在同一个碳原子上，由于诱导效应，pK均有明显降低
在水溶液中氨基酸的氨基和羧基的解离程度不同，所以氨基酸水溶液一般不呈中性
酸性比碱性强一点
三类氨基酸等电点
中性氨基酸
5.0~6.3
酸性氨基酸
2.8~3.2
碱性氨基酸
7.6~10.9
由于氨基酸的两性电解性质，氨基酸可以作为缓冲试剂
等电点的计算
酸性电离和碱性电离的和的一半
氨基酸在pH大于等电点的溶液中以阴离子存在，在pH小于等电点的溶液中主要以阳离子存在
化学性质
与水合茚三酮
反应
一般氨基酸
加热、弱酸
氨基酸经过氧化脱氢、脱羧
蓝紫色复合物
脯氨酸和羟脯氨酸
不释放氨，直接产生黄色物质
应用
反应非常灵敏，几微克就能显色
A570nm与氨基酸含量在一定范围内成正比，因此可以测定样品中氨基酸含量
可以做纸层析、柱层析、电泳技术分离氨基酸的显色剂，定性或定量的测定各种氨基酸
缺点：多肽或蛋白质灵敏度较差
与甲醛
应用
氨基酸的甲醛滴定
大体判断蛋白质水解或合成的进度
与2,4-二硝基氟苯（FDNB）
反应
弱碱
生成2,4-二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），黄色
应用
非极性溶剂提取后，再用纸层析分析，可以从图谱上黄色斑点的位置鉴定N端氨基酸的种类和数目
坚定多肽或蛋白质的N端（末端）氨基酸
Sanger法
与5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl，又称丹磺酰氯）
与FDNB同样的效果
反应
产生5-二甲氨基萘磺酰氨基酸（DNS-氨基酸），具有强烈的荧光
应用
荧光光度计检出，灵敏度高，微量就可以测定其N端氨基酸
与异硫氰酸苯酯（PITC）
反应
弱碱
氨基酸的氨基与异硫氰酸苯酯反应，生成苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）
酸作用，PTC-氨基酸环化为苯硫乙内酰脲（PTH），在酸中极其稳定
应用
多肽链N端氨基酸也能与PITC反应
该法由P.V.Edman在20世纪50年代创立，也称Edman降解法或Edman反应
反应后形成
一个PTH-氨基酸
多肽链（比原多肽链少一个氨基酸）
可以测得其N端的氨基酸，反复多次可测定出多肽链N端的氨基酸序列
与亚硝酸
反应
室温，三四分钟即可完成反应
反应放出氮气，一个氮来源于氨基酸，一个来源于亚硝酸
应用
计算氨基酸的量
范斯莱克法
氨基如果不在a位置则反应较慢
光谱性质
光吸收
可见光区没有光吸收
院子外区（小于200nm）有光吸收
三种紫外吸收力
苯丙氨酸
257nm
酪氨酸
275nm
这要为这两种，最大紫外吸收在280nm左右
色氨酸
280nm
一般蛋白质很少含或不含此氨基酸
蛋白质含这些氨基酸，就有紫外吸收能力
核磁共振
波普学通过分析1H NMR或13C NMR来确定氨基酸或蛋白质共价结构
高磁场NMR可用来测定蛋白质的三维结构
肽
结构
1899~1908H.E.Fischer用合成寡肽的方法证明了氨基酸是通过肽键（酰胺键）结合形成的多肽
多肽为链状结构，剩余部分称为氨基酸的“残基”，R基称侧链
肽的分类
2个氨基酸残基的称为二肽
3个、4个氨基酸残基的称为三肽、四肽
超过12个但不多于20个残基的称为寡肽
20个以上的称为多肽
肽和蛋白质之间没有严格的划分
肽的性状
绝大多数：线性无分支
少数：有分支
通过氨基酸残基R基和羧基以异肽键的形式相连
通过异肽键和其他连接方式使多条肽链形成交联
肽的书写
N端放在左边，C端放在右边
命名时，从N端开始，连续读出，除C端氨基酸外，所有“酸”改为“酰”
只知道氨基酸的组成，而不知道氨基酸序列的，可将氨基酸组成写在括号内，并用逗号隔开
肽的研究
研究历程
1953年V.du Vigneaud首先完成了生物活性肽催产素的合成
1963年R.B.Merrifield建立了固相肽类合成的方法，随后逐步完善，并实现自动化
1965年中国科学家完成了牛结晶胰岛素的人工合成，第一个人工合成多肽类活性物质
模型研究
X射线衍射法研究肽模型
发现肽键具有约40%的双键性质
不能旋转，使相关的6个原子处于同一平面，称作肽平面或酰胺平面
肽平面内两个Cα多处于反式结构
顺时针旋转为正值
逆时针旋转为负值
N-Cα键旋转的角度为Φ
Cα-C键旋转的角度为Ψ
在双键共振状态中，肽键具有永久偶极
肽骨架的化学反应性相对较低
生物活性肽
能够调节生命活动或具有某些生理活性的寡肽和多肽的总称
作用机制
调节体内有关酶类
保障代谢途径的畅通
通过控制转录和翻译二影响蛋白质的合成，最终产生特定的生理效应
几类活性肽
谷胱甘肽
三肽，存在于动植物、微生物中
由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成（简称GSH）
有还原型和氧化型两种
作用
GSH可作为重要的还原剂保护体内蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使酶或蛋白质处在活性状态
GSH的巯基还具有嗜核特性，能与外源的嗜电子物质如致癌剂或药物等结合，从而阻断这些化合物与DNA、RNA或蛋白质结合，保护机体免遭损害
催产素和加压素
属于神经激素，是下丘脑神经细胞合成的寡肽激素
都是九肽，分子中都有环状结构
不同
催产素
使子宫和乳腺平滑肌收缩
具有催产及使乳腺排乳
促进遗忘
加压素
也称抗利尿激素
促进血管平滑肌收缩，从而升高血压
具有减少排尿
环状部分参与学习记忆的巩固
直线部分参与记忆的恢复
促肾上腺皮质激素（ACTH）
作用
刺激肾上腺皮质的生长
促进肾上腺皮质激素的合成和分泌
其他部位分泌的ACTH
大脑
参与意识行为的调控
垂体
作用于肾上腺
化学合成的
临床上用于柯兴氏综合征的诊断
风湿性关节炎
皮肤和眼睛炎症
脑肽
高等动物脑中的镇痛作用强于吗啡的活性肽
胰高血糖素
促进肝糖原降解产生葡萄糖
引起血管舒张、抑制肠的蠕动及分泌
分析技术
多肽链的分离
尿素
盐酸胍
高浓度盐
分开蛋白质亚基
二硫键的断裂
氨基酸组成的分析
N端氨基酸的鉴定
DNFB反应（2,4-二硝基氟苯反应）
丹磺酰氯反应
Edman反应
C端氨基酸的鉴定
羧肽酶法
羧肽酶可以从多肽链的C端逐个降解，释放出游离的氨基酸
多肽链的裂解
肽段氨基酸序列的测定
Edman降解法
质谱法
核苷酸序列推定法
肽段的拼接
二硫键位置的确定
分离技术
根据溶解度不同进行分离
盐析
等电点沉淀法
低温有机溶剂沉淀法
根据分子大小进行分离
透析与超滤
凝胶过滤法
根据带电性质进行分离
电泳法
离子交换层析法
根据配体特异性进行分离
亲和层析法
性质
分子量
蛋白质的分子量（Mr）差异较大，一般在10 4 ~10 6 之间
常用的测定方法
渗透压法
设备要求低
准确度较差
超离心法
昂贵且耗时
凝胶过滤法
（SDS-）聚丙烯酰氨凝胶电泳
快速
简单
准确度较高
耗费较少
只能测亚基的分子量
常用测定法
两性电离
等电点
变性
受物理或化学因素影响，其分子内部原有的高度规律性结构发生变化，导致蛋白质的理化性质和生物学性质都有所改变，但蛋白质的一级结构不被破坏
变性后的蛋白质称为变性蛋白质
1931年，中国生物化学家吴宪指出：变性作用的实质是肽链从卷曲变伸展的过程
变性因素
化学因素
强酸
强碱
尿素
胍
去污剂
重金属盐
磷钨酸
苦味酸
浓乙醇
等
物理因素
加热（70℃~100℃）
剧烈震荡或搅拌
紫外线
X射线照射
超声波
等
结絮作用和凝固作用就是变性程度深刻化的表现，达到了不可逆的变性
复性
变性作用不过于剧烈，在一定条件下可以恢复活性
说明
空间结构是由一级结构决定的
体内蛋白质形成空间结构还需要被称作分子伴侣的蛋白质协助
作用
主要是分子内部的氢键等次级键被破坏
分子从原来有秩序的卷曲紧密结构变为无秩序的松散伸展状结构
一级结构不会被破坏，组成成分和分子量不变
亲水基团减少，容易相互碰撞发生聚沉
松散状态比较容易相互缠绕，聚集沉淀
变性后溶解度下降原因
胶体性质
分子量大，在水溶液中形成的颗粒（直径在1~100nm之间）具有胶体的效应
具有的胶体特征
布朗运动
丁达尔现象
电泳现象
不能透过半透膜
分离纯化蛋白质：透析法
具有吸附力
各种极性和非极性基团
极性基团
水溶性物质结合
非极性基团
脂溶性物质结合
当水与蛋白质相遇时，就很容易被蛋白质吸引，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜（又称水化层）
蛋白质颗粒表面许多极性基团和水具有高度亲和性
沉淀
在蛋白质溶液中加入适当试剂，破坏蛋白质的水膜，或中和蛋白质的电荷，蛋白质就会从胶体溶液中沉淀出来
方法
盐析法
加入高浓度盐类
硫酸铵
硫酸钠
氯化钠
中性盐
蛋白质不变性
常用于分离制备有活性的蛋白质
不同蛋白质盐析所需要的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可以使蛋白质分段析出，称为分段盐析
加有机溶剂
可以破坏蛋白质分子周围的水膜
蛋白质溶液的pH在等电点时，沉淀效果最好
低温条件下，有机溶剂沉淀的蛋白质一般不变性，且沉淀效果比盐析的好
加重金属盐类
种类
氯化高汞
硝酸盐
醋酸铅
三氯化铁
正离子作用生成不易溶解的盐
沉淀的蛋白质是变性的，效率高
除去蛋白质中的杂质
加某些酸
种类
苦味酸
单宁酸
三氯乙酸
不溶解的盐
沉淀的蛋白质变性
除去蛋白质中的杂质
加热
可是大部分变性沉淀
部分加热变性后不沉淀
颜色反应
双缩脲反应
双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物
双缩脲在碱性溶液种能与硫酸铜反应产生紫红色的络合物
蛋白质中有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此有双缩脲反应
定性鉴定蛋白质
根据反应产生颜色在540nm处比色（定量测定蛋白质）
酚试剂（福林试剂）
蛋白质一般都含酪氨酸，酪氨酸中的酚基能与福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（钼蓝与钨蓝的混合物）
含量测定
考马斯亮蓝染色法
用考马斯亮蓝室温下染色
反应迅速（约2分钟）
灵敏度较高
紫外吸收法
蛋白质中存在酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸
直接测在280nm和260nm处的吸光值
凯氏定氮法
其他方法
微量可溶性蛋白
胶体金法
免疫学方法
有活性的
直接测定其生物活性
结构与功能的关系
一级结构与功能关系
种属差异
不同机体中有同一功能的蛋白质（同源蛋白质）氨基酸序列有明显的共性，也有一定的种属差异
X射线衍射分析证明，不同来源的胰岛素空间结构大致相同，一些非极性氨基酸对维持胰岛素的高级结构起重要作用
亲缘关系越近，结构越相似（生物种类）
分子病
某种蛋白质分子中的氨基酸发生突变导致的遗传病
每种蛋白质都具有其特定的结构来完成它特定的功能，个别氨基酸的变化就能引起功能的改变或丧失
蛋白质结构与功能的高度统一性
构象与功能的关系
蛋白质的功能通常取决于它的特定构想
别构相应
蛋白质表现其生物功能的一种相当普遍而又十分重要的现象
某些蛋白质表现其生物功能时，构象发生变化，从而改变了整个分子的性质
免疫球蛋白
可变区（V区）
靠近N端的氨基酸的序列变化很大
恒定区（C区）
靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定
结构
一级结构
肽链中的氨基酸序列
胰岛素
降低体内血糖含量
促进糖原、三酰甘油和蛋白质合成
一级结构是蛋白质最基本的结构
空间结构
是指蛋白质分子中所有原子在三维空间的分布和肽链的走向
通常称作蛋白质的构象，或高级结构
研究方法
X射线衍射法
蛋白质纯化后制成结晶，用X射线衍射发测定原子间的距离，得出肽链走向的数据
核磁共振法
测定溶液中蛋白质的构象
缺点：分辨率比X射线衍射法低
空间稳定力
次级键
氢键
盐键
不同电荷间的静电引力
相同电荷间的静电斥力
疏水作用（疏水键）
范德华力
范德华力很弱，但可以通过力的加和
二级结构
指多肽主链有一定的周期性的，由氢键维持的局部空间结构
结构类型
ɑ螺旋
发现
1951年L.C.Pauling等通过分析X射线数据发现，随后证实
存在
广泛存在于纤维状蛋白和球状蛋白
基本结构信息
一周螺旋
由氢键封闭形成的环含有13个原子
3.6个氨基酸
螺距
0.54nm
两个间距
0.15nm
螺旋直径
0.6nm
所带电荷
N端带有部分正电荷
C端带有部分负电荷
可以形成偶极矩
螺旋
L型氨基酸组成的α螺旋多为右手螺旋
D型氨基酸组成的α螺旋多为左手螺旋
同一个螺旋中的氨基酸必须是同一种构型
L型和D型的共聚物不能形成α螺旋
右手螺旋比左手螺旋稳定
典型的α螺旋中，螺旋的头4个酰胺H和最后4个羰基O不参与螺旋中氢键的形成
α螺旋的两端可以与蛋白质其他部分的氢键配偶体相互作用，使其形成氢键
螺旋的帽化
股内形成氢键
形成影响
不同氨基酸的R基对α螺旋的形成有明显的影响
R基太小，使键角自由度过大
带同种电荷的R基相互靠近
β-碳原子上有分支
β折叠
主链沿纸条形成锯齿状，R基垂直于折叠平面
形式
平行式
多条肽链构成
相邻肽链同向
比反平行更规则
氢键有明显的弯折
每个残基长度是0.325nm
一般是大结构，少于5条肽链的很少见
反平行式
特殊形式
β凸起
额外插入了一个残基
改变程度不如β转角
同一条肽链回折构成
相邻肽链反向
每个残基长度是0.347nm
仅有两条肽链组成
氢键主要在股间形成
β转角
第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H形成氢键，构成一个紧密的环
β转角有两种类型，二者的区别是中间的肽基旋转了180°
无规卷曲
不能或未能归入上述明确的二级结构的蛋白质肽段
并非随意卷曲，也不完全无规则
有一定的任意性
具有相对明确而稳定的结构
这类经常构成酶的活性部位和其他蛋白质特异的功能部位
超二级结构和结构域
是蛋白质二级结构和三级结构的过渡态构象
超二级结构
1973年M.G.Rossman提出
若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体
结构类型
αα
βαβ
βαβαβ
ββ
等
结构域
1973年Rossman提出
多肽链在超二级结构基础上进一步盘绕折叠成的近似球状的紧密结构
较大的蛋白质分子或亚基
由两个或两个以上相对独立的结构域缔合成三级结构
较小的蛋白质
只有一个结构域
则结构域=三级结构
三级结构
指多肽链上包括主链和侧链在内的所有原子在三维空间内的分布
球蛋白分子
包含一定数量的α螺旋和β折叠
具有明显的层次性，整个分子折叠成近似球状的紧密实体
疏水侧链多分布在分子内部，亲水侧链多分布在分子表面
分子表面有空穴，是结合配体，行使生物学功能的活性部位
空穴通常是一个疏水区域
四级结构
许多蛋白质由两个或两个以上的具有三级结构的亚单位组成，每个亚单位称为亚基
一个亚基可以有一条肽链，也可以有多条肽链
分子中亚基的种类、数量以及相互关系
亚基间通过非共价键聚合而形成特定的构象
血红蛋白
4条肽链（两个亚基）