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基因工程① (DNA重组技术)
概念
原理:基因重组
操作环境:生物体外
操作水平:DNA分子水平
主要技术:体外DNA重组和转基因等技术
特点:①定向改变生物性状 ②目的性强，打破远缘杂交不亲和的障碍
基本工具
限制性核酸内切酶 (限制酶)
主要来自原核生物，大多由6个核苷酸组成
酶具有专一性:①识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列 ②切割特定核苷酸序列中的特定位点
作用:断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键
结果:产生黏性末端或平末端
DNA连接酶
作用:恢复磷酸二酯键 (连接具有相同或互补黏性末端和平末端，形成重组DNA分子)
分类:①从大肠杆菌中分离得到的E·coli DNA连接酶(黏) ②从T4噬菌体分裂出来的T4 DNA连接酶 (黏和平，连接平之间效率低)
载体
种类:质粒(人工改造过的)，λ噬菌体的衍生物(噬菌体的宿主是细菌)，动植物病毒
作用:①把目的基因转运到受体细胞 ②携带目的基因在受体细胞内大量复制
质粒:①在受体细胞中稳定存在并能复制(②裸露，小型，双链，环状，独立于细菌拟核DNA之外的DNA分子)③有一个至多个限制酶切割位点④有特殊的标记基因⑤无毒害作用
操作程序
目的基因的获取
目的基因:编码蛋白质的基因，具有调控作用的因子
获取方法:
基因文库中获取
概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因
分类:①基因组文库(包含一种生物所有基因)②部分基因文库 (包含一种生物部分基因，如cDNA文库)
物种间的基因交流:基因重组
PCR技术扩增(多聚酶链式反应)(PCR扩增仪) 概念:生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 原理:DNA的双链复制 原则:碱基互补配对原则 条件:①DNA模板(有目的基因的核苷酸序列) ②热能(目的基因DNA受热变性后解链为单链 ③引物(根据已知目的基因的核苷酸合成，引物一般有两个，也就是一对，方向是相向的) ④Taq酶(热稳定DNA聚合酶) ⑤四种脱氧核苷酸
人工合成法:基因比较小，核苷酸序列已知。通过DNA合成仪用化学方法人工合成
构建基因表达载体(核心)
目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在，可遗传给下一代。能够表达和发挥作用。
组成:启动子，终止子 (特殊结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位:使转录开始或停止，在基因的首端或尾端。基因中启动子的碱基序列不能被转录，因为启动子启动转录但不参与转录过程) 标记基因(常用抗生素抗性基因，目的:筛选含有目的基因的细胞) 复制原点(使基因复制和传递) 目的基因
目的基因导入受体细胞 (没有涉及碱基互补配对)
转化含义:将目的基因导入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达
方法
植物细胞
①最常用方法农杆菌转化法(双子叶或裸子) ②基因枪法(单子叶)(贵) ③花粉管通道法(适用于所有开花植物)(抗虫棉)
农杆菌转化法(利用农杆菌将目的基因导入受体细胞):将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上↪用CA2+处理农杆菌细胞，使其处于感受态↪将基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞↪植物体受到损伤，伤口处的细胞分泌大量的酚类化合物吸引农杆菌移向细胞，农杆菌导入植物细胞↪Ti质粒上的T-DNA转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上↪目的基因表达
受体细胞可选植物体细胞
动物细胞
显微注射技术(常用受精卵
微生物细胞
Ca2+处理细胞:感受态细胞:(原核生物，大肠杆菌 原核生物的特点(大肠杆菌作为理想受体细胞的优点):繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少
目的基因的检测与鉴定 (都在体外进行)
检测与鉴定:目的基因导入受体细胞后是否可以维持稳定和表达其遗传特性
分子水平检测
转基因生物的DNA上是否插入了目的基因:DNA分子杂交技术
目的基因是否转录出mRNA:分子杂交技术
探针:荧光或含有放射性同位素标记的含有目的基因的DNA单链
目的基因是否翻译成蛋白质:抗原-抗体杂交(从转基因生物中提取蛋白质作抗原，利用抗原抗体特异性结合的原理) ps:如果最终产物不是蛋白质,就不能用这种方法
成功标志:出现杂交带
个体生物学水平检测
接种法，产物功能活性比较法
