导图社区 生物化学：蛋白质化学
蛋白质结构基本知识，包括结构划分，各结构层次涵盖的内容。
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蛋白质Protein
分子组成
元素组成
C,H,O,N,S及微量p ☞不同蛋白质的含N相似，16%
定氮法计算蛋白质含量 每克样品含氮克数×6.25×100=100g样品中蛋白质含量（g%）
氨基酸
20种常见氨基酸
R基非极性
丙氨酸Ala
缬氨酸Val
亮氨酸Leu
异亮氨酸Ile
甲硫氨酸Met
脯氨酸Pro 亚氨基酸
苯丙氨酸Phe
色氨酸Trp
极性不带电荷
丝氨酸Ser
苏氨酸Thr
酪氨酸Tyr
半胱氨酸Cys 含巯基且可使 肽链间形成共价键二硫键
天冬氨酸Asn
谷氨酸Gln
甘氨酸Gly 第一个被鉴定出来 的蛋白质氨基酸，也是结构最 简单的氨基酸（不含手性碳原子）
酸性
天冬氨酸Asp
谷氨酸Glu
碱性
精氨酸Arg
赖氨酸Lys
组氨酸His
理化性质
两性解离与等电点PI
强碱中，偶极离子作为质子供体 强酸中，偶极离子作为质子受体
生理pH环境下， 只有组氨酸具有 明显的缓冲作用
PI=1/2（PK1+PK2） pI＜pH氨基酸带正电荷 pI＞ pH氨基酸带负电荷
氨基酸的吸收光谱
常见氨基酸在可见光区没有吸收， 在红外区和远紫外区都有光吸收， 近紫外区主要有三个芳香族氨基酸有 吸收，蛋白质最大吸收波长一般为280nm
氨基酸的化学反应
茚三酮反应 弱酸条件下生成蓝紫色复合物 其吸收峰在570nm 注:脯氨酸.羟脯氨酸生成的产物为黄色，吸收峰为440nm
Sanger反应 弱碱条件，生成稳定的黄色物质2,4－二硝基苯基氨基酸
Edman反应 弱碱条件，苯异硫氰酸酯（PITC）与氨基酸的α－氨基反应生成PTH－氨基酸☞有较强紫外吸收，最大吸收峰在280nm
稀有氨基酸: 4－羟基脯氨酸和5－羟基赖氨酸 ☞胶原蛋白主要组成成分 第21种氨基酸:硒代半胱氨基酸（Sec） 第22种氨基酸:吡咯氨基酸 非蛋白质氨基酸:在生物体内，不参与蛋白质组成的氨基酸
氨基酸通过肽键连接形成蛋白质或肽
肽键概念
一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基脱水形成的酰胺键称为肽键
肽键具有部分双键性质，不能自由旋转， 蛋白质中肽键以反式构型为主
多肽链概念
两个或以上的氨基酸脱水缩合形成若干个肽键从而组成一个肽，多个肽进行多级折叠就组成一个蛋白质分子。蛋白质也被称为“多肽”
天然活性肽 如:谷胱甘肽（GSH）在生物体内起氧化还原缓冲剂的作用
分子结构
一级结构
第一个测到为牛胰岛素
概念:在蛋白质中从N-端到C-端的氨基酸排列顺序称为蛋白质一级结构
稳定因素
主要化学键为肽键，二硫键也属于范畴内
蛋白质测序
测序前
纯化蛋白质,确定肽链和亚基数目,断裂二硫键,分离纯化不同的肽链或亚基，水解肽链
断裂二硫键的方法:过甲酸氧化法和巯基试剂还原法
测序
①采用两种以上方法断裂肽链②测定每个小肽的序列
末端氨基酸残基测定 ①N－末端☞丹磺酰氯.PITC法.氨肽酶法.DNFB法 ②C－末端☞肼解法.羧肽酶法.还原法
结构重构
①确定完整肽链的序列②确定二硫键和酰胺的位置
二硫键位置确定:对角线电泳法
二级结构
概念:指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，也就是该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象
组成
1.α-螺旋
α－螺旋的结构特点如下： ①多个肽键平面通过α－碳原子旋转，相互之间紧密盘曲成稳固的右手螺旋。 ②主链呈螺旋上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm，每个氨基酸上升0.15nm。③多肽链中第n个氨基酸残基中的C＝O中的O与n+4个氨基酸残基的－NH中的H形成氢键，这是稳定α－螺旋的主要键。 ④肽链中氨基酸侧链R，分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响α－螺旋的形成。
2.β-折叠
β-折叠是一种肽链相当伸展的周期性结构。 ①相邻肽键平面间折叠成110°角，呈锯齿状。 ② 两个以上具β-折叠的肽链或同一肽链内不同肽段相互平行排列，形成β-折叠片层，其稳定因素是肽链间的氢键。 ③ 逆向平行的片层结构比顺向平行的稳定。
3.β-转角
为了紧紧折叠成球蛋白的紧密形状，多肽链180°回折成发夹或β-转角。其处由4个连续的氨基酸残基构成，常有Gly和Pro存在，稳定β-转角的作用力是第一个氨基酸残基羰基氧（O）与第四个氨基酸残基的氨基氢（H）之间形成的氢键。β-转角常见于连接反平行β-折叠片的端头。
4.无规卷曲
稳定因素:维系二级结构的作用作用力是氨基酸残基非侧链基团之间形成的氢键
三级结构
肌红蛋白是第一个被阐明三级结构的蛋白质
概念:指一条多肽链中所有原子的整体排布，包括主链和侧链
维系三级结构的作用力主要是次级键或非共价键（疏水相互作用、静电力、氢键.范德华作用力等）
四级结构
血红蛋白是最早最深入研究四级结构的蛋白质
概念
具有特定三级结构的肽链主要通过非共价键形成的大分子组合体系称为蛋白质的四级结构。四级结构中那些具有特定三级结构的肽链被定义为亚基
性质
蛋白质的四级结构包括亚基的种类.数目.空间排布及亚基间的相互作用
血红蛋白
俩个α亚基和俩个β亚基组成的四聚体，每个亚基结合一分子血红素，血红蛋白除了运输氧还可以与CO2和氢离子结合
蛋白质结构与功能的关系
蛋白质主要功能
构成细胞和生物体结构
物质运输
催化功能
信息交流
免疫功能
氧化供能
维持机体的酸碱平衡
维持正常的血浆渗透压
蛋白质一级结构与功能的关系
（一）一级结构是空间构象的基础
一级结构的改变往往引起蛋白质功能的改变
（二）一级结构的序列比较
一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间结构和功能也相似，不同种属的同源蛋白质有同源序列，一级结构的相似性称为序列的同源性
细胞色素c(Cyt c)
保守残基
可变残基
（三）分子病
镰刀型细胞贫血症:β链N－端第6个氨基酸发生置换，由谷氨酸残基变成了缬氨酸残基，血红蛋白有俩条β链，所以整个蛋白质分子仅有俩个氨基酸发生了替换，却导致发生了病变。
二、蛋白质空间结构与功能的关系
牛核糖核苷酸酶A被高浓度脲破坏肽链的次级键，被巯基乙醇还原二硫键，发生了空间结构的改变，失去活性
肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）都能与氧进行可逆的结合，氧结合在血红素辅基上。然而Hb是四聚体分子，可以转运氧；Mb是单体，可以储存氧，并且可以使氧在肌肉内很容易地扩散。它们的氧合曲线不同，Mb为一条双曲线，Hb是一条 S型曲线。在低p(O2)下，肌红蛋白比血红蛋白对氧亲和性高很多，p(O2)为2.8torr(1torr≈133.3Pa)时，肌红蛋白处于半饱和状态。在高p(O2)下，如在肺部（大约100torr）时，两者几乎都被饱和。其差异形成一个有效的将氧从肺转运到肌肉的氧转运系统。 Hb未与氧结合时，其亚基处于一种空间结构紧密的构象（紧张态，T型），与氧的亲和力小。只要有一个亚基与氧结合，就能使4个亚基间的盐键断裂，变成松弛的构象（松弛态，R型）。T型和R型的相互转换对调节Hb运氧的功能有重要作用。一个亚基与其配体结合后能促进另一亚基与配体的结合是正协同效应，其理论解释是Hb是别构蛋白，有别构效应。
构象病
朊病毒
蛋白质的重要性质
两性解离性质
主要影响蛋白质解离的是肽链中各氨基酸残基的侧链基团如:ε－氨基.β－羧基.γ－羧基等等，
概念:蛋白质是两性电解质，可以与酸碱反应，蛋白质中可解离的基团包括N－端和C－端游离的α－氨基和α－羧基
蛋白质分子表现为电中性时，此特定pH值即等电点。 处于等电点的蛋白质分子表面净电荷为0，形成稳定胶体的条件被破坏，容易出现沉淀。此等电点时，蛋白质的溶解度最低，同时黏度.渗透压.导电性也处于最小值。
具有胶体性质
维持蛋白质胶体稳定性的三个因素:双电层、水化膜、分子大小介于1－100nm
蛋白质的变性与复性
变性
概念:蛋白质在某些理化因素的作用下，维系天然构象的次级键被破坏，蛋白质失去天然构象，导致理化性质改变，生物学活性丧失，称为蛋白质的变性
主要表现:失去生物活性，蛋白质溶解度降低，易被蛋白质水解酶消化，粘度增加，结晶能力消失
引起变性的因素（变性剂） 物理:加热，紫外线及，X射线照射，高压等等 化学:有机溶剂，脲，胍以及酸碱等等
复性
概念:指变性作用不过于剧烈的一种可逆反应，去除变性因素，有些蛋白质原有的构象和功能可恢复或部分恢复，称为复性
根据变性条件是否破坏蛋白质三 维结构判断是可逆还是不可逆变性
蛋白质的沉淀
高浓度中性盐沉淀蛋白质
盐析:高浓度盐溶液中，大量盐离子夺取蛋白质分子表面的水分子，破坏蛋白质表面的水化层，使得蛋白质溶解性降低而沉淀
盐析一般不引起蛋白质的变性，除去盐后，蛋白质可以重新溶解☞应用:分级沉淀法对蛋白质进行分离纯化
盐溶:低浓度盐溶液中，中性盐使蛋白质分子可以吸附少量相反电荷的盐离子，起到稳定双电层的作用，增加了蛋白质的溶解性
有机溶剂沉淀蛋白质
原理:有机溶剂加入蛋白质溶液中，会破坏蛋白质分子的水化层，使蛋白质脱水沉淀，还会降低蛋白质分子的介电常数，降低蛋白质的溶解度，产生沉淀。
应用:有机溶剂分级沉淀法 ☞操作时控制溶液pH在蛋白质等电点附近，加有机溶剂使蛋白质沉淀。由于有机溶剂容易使蛋白质变性所以一般在低温进行
重金属离子沉淀蛋白质
原理:当蛋白质分子带负电荷，能够与重金属离子结合形成不溶性重金属蛋白盐沉淀
重金属盐通常会引起蛋白质的变性而造成中毒
生物碱试剂沉淀蛋白质
原理:当蛋白质处于低于等电点的pH环境下，蛋白质带正电荷，此时带负电荷的生物碱试剂能够与蛋白质反应生成不溶性盐，从而使蛋白质沉淀
在紫外光谱区有特征性光吸收280
呈色反应可测定溶液中蛋白质
茚三酮
用途:鉴定游离氨基酸及蛋白质
双缩脲（两个以上相邻肽键）
用途:蛋白质含量测定
福林试剂
用途:鉴定含Tyr残基的蛋白质，蛋白质含量测定
蛋白质的分类
按分子组成
简单蛋白
简单蛋白质完全水解的产物仅为α-氨基酸。这类蛋白质按其溶解度等理化性质分为7类。包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、精蛋白、组蛋白和硬蛋白。
结合蛋白
根据辅基的不同，这类蛋白质可分为8类。如核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、金属蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白、黏蛋白和磷蛋白。
按分子形状
球状蛋白
纤维状蛋白
膜蛋白
按功能
活性蛋白
酶
激素蛋白质
运输和贮存蛋白质
运动蛋白质
受体蛋白质
非活性蛋白
胶原蛋白
角蛋白
按结构
全α域型蛋白质
全β域型蛋白质
α.β分离型蛋白质
多结构域型蛋白质
α.β域相同型蛋白质
膜及细胞表面蛋白质
蛋白质的分离纯化
总原则:保证蛋白质生物活性，达到研究所需的纯度，获得最高的产量（过程保持低温）
一般程序:前处理，粗分级，细分级
分离纯化技术
透析与超过滤
透析，利用小分子物质能够透过半透膜，而蛋白质分子不能透过半透膜的特点，使蛋白质与小分子物质分离
超过滤，以压力差为推动力，促使蛋白质溶液通过具有特点孔隙大小的膜来进行分离
电泳技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（用于测定蛋白质分子量）
等电聚焦电泳
蛋白质双向电泳
层析技术
凝胶过滤层析
离子交换层析
亲和层析
超速离心
生物质谱技术分析
概念☞分子病是指机体DNA分子上基因缺陷引起mRNA分子异常和蛋白质生物合成的异常
肌红蛋白是单体蛋白质，只有独立三 级结构没有四级结构。血红蛋白是寡 聚蛋白质，具有四级结构
构象病是由于肽链的错误折叠而引起的
蛋白质变性不涉及肽键的断裂， 即蛋白质的一级结构保持完整
