蛋白质和酶的分子设计

下图共包括四大分支：蛋白质或酶分子改造和设计的目的、蛋白质或酶分子的改造、蛋白质分子设计的分类、定向进行和自然进化的差别。

9_蛋白质和酶的分子设计

• 蛋白质或酶分子改造和设计的目的
  • 设计原因：天然酶的局限性
    • 在机体外复杂体系中，酶催化的精确性较低
    • 存在产物抑制
    • 稳定性差，活性低，催化效率低
    • 有些缺乏有商业价值的催化功能及其它性质
  • 现代生物工程要求
    • 高稳定性和活性
    • 适用于水相和非水相
    • 能接受不同底物甚至自然界不存在的底物
    • 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料
• 蛋白质或酶分子的改造
  • 理性设计
    • 利用各种生物化学、晶体学和光谱学等方法获得蛋白质或酶分子特征、空间结构以及结构与功能的关系等方面信息，然后根据这些信息进行蛋白质或酶分子的改造
  • 非理性设计
    • 不需准确知道酶蛋白结构与功能等信息，直接通过 随机突变、基因重组、定向选择或筛选等方法进行酶分子的改造，称为酶 分子的非理性设计。
  • 定向进化和定点突变
    • 定向进化：突变，筛选。突变的位点、数目、效应都不确定。任何可以引起突变的因素都可以应用于定向进化。
    • 定点突变：突变的位点、个数是确定的，突变的效应可以是预知的或者不预知的。一般以PCR为基础。
• 蛋白质分子设计的分类
  • 两大类
    • 根据对蛋白质改造的程度（3类）
      • 小改：通过定点突变或化学修饰来实现
      • 中改：对不同蛋白质的结构域进行拼接组装，改变蛋白质功能特性的方法
      • 大改：全新蛋白质的从头设计
    • 根据改造对象（2类）
      • 基于天然蛋白质结构的分子设计
      • 全新蛋白质的分子设计
  • 蛋白质分子设计流程
    • 构建蛋白模型——建立和优化突变体模型——获得突变体——结构和功能分析验证——新的蛋白质。一般需要多次循环才能达到目的。
• 定向进化和自然进化的差别
  • 定向进化
    • 从一个或多个已经存在的亲本酶出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选获得希望获得的酶
    • 定向进化=随机突变+正向重组+选择或筛选
    • 三个基本策略
      • 连续突变筛选最佳单一突变体
      • 单一突变体再次突变筛选改进的突变体（有益突变组合，消除有害突变）
      • 同源基因顺序重组（族改组）产生功能嵌合蛋白，并允许一步完成许多有益突变的组合
    • 两个重要环节
      • 多样性基因文库构建
      • 从文库挑选期望的进化酶
    • 定向进化步骤
      • 随机突变或基因体外重组创造基因多样性
      • 导入适当载体后构建突变文库
      • 通过灵敏的筛选方法选择阳性突变子（循环此步直至得到期望酶）
    • 基本方法
      • 无性进化
        • 易错 PCR、定点饱和突变、化学诱变剂介导的突变、致突变株产生随机突变 和随机寡核苷酸突变等
          • 代表：易错PCR
            • 通过改变 PCR 反应条件，使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变。 关键是控制 DNA 的突变频率
              • PCR得到的多态性基因怎么装载到细胞上并表达筛选？
            • 优点：操作简便，随机突变丰富 缺点：正突变的概率低，中性突变较多，突变基因文库较大，文库筛选工作量大，一般适用于较小基因（<800bp)
            • 连续易错PCR
              • 将第一轮 PCR 扩增得到的有益突变基因作为下一次 PCR 扩增的模板，连续 反复进行随机突变，使每一轮获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。
      • 有性进化
        • DNA 改组（DNA shuffling）、外显子改组（exon shuffling）、随机引物体外重 组法（RPR）、交错延伸法（StEP）等
          • 代表：DNA改组
            • DNA改组与常规定向进化的比较： 
            • 通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能
            • 基本过程
              • 从两种以上同源正突变基因出发，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次 PCR 循环（片段配对后互为引物），使 DNA 的碱基序列重新排布而引起基因突变。
              • 具体步骤：各种同源正突变混合——DNA酶切割产生片段——各随机片段互为模板和引物进行PCR扩增——亲本基因群中优势突变尽可能组合在一起——筛选产生进化酶的全长基因
            • 优点：正突变概率高，进化速度快 缺点：进行无引物PCR时需要将DNase去除干净防止突变基因被再次切割
            • 改进1
              • 交错延伸技术
                • 用 PCR 同时扩增多个拟重组的模板序列时，在热循环中大大缩短退火与聚合酶催化延伸的时间
            • 改进2
              • 体外随机引动重组
                • 用随机序列为引物来产生互补于模板序列不同部分的大量的DNA小片段
          • 基因家族改组（族改组）
            • 和DNA改组类似
            • 基因家族改组从若干同源基因出发进行DNA序列的重新排布，DNA改组从易错PCR获得的正突变基因出发进行DNA序列的重新排布
            • 缺点：同源性高，获得杂合体几率低
  • 酶突变基因的筛选技术
    • 平板筛选法
      • 根据细胞生长情况筛选突变基因
        • 可筛选热，pH，渗透压，毒物，抑制剂与抗生素方面的突变菌
      • 根据颜色变化筛选突变
        • 最简便的追踪酶反应的方法。大多数酶不能直接引起颜色变化，当检测没有生色基团底物的反应，要将底物转变为有色化合物
      • 根据透明圈筛选突变酶
    • 荧光筛选法
      • 需要有荧光激发基因作为报告基因，指示目的基因的情况
    • 噬菌体表面展示法
      • 噬菌体表面展示法是将外源蛋白或多肽以与噬菌体外膜结构蛋白（衣壳蛋白）融合的形式表达并展示在噬菌体表面的一种分子展示技术
    • 细胞表面展示法
      • 通过可以锚定在细胞表面的特定蛋白质与某些外源蛋白质或多肽形成稳定的复合物，使这些外源蛋白质或多肽富集在细胞表面的一种分子展示技术
      • 酿酒酵母细胞表面展示法
      • 细菌细胞表面展示法
    • 核糖体表面展示法
  • 定向进化的应用
    • 提高酶分子催化活力
    • 提高酶分子稳定性
    • 提高酶分子对环境适应力
    • 提高底物专一性或拓宽底物特异性
    • 提高对对映体的选择
    • 创造新的酶活性
•  掌握有关酶分子定向进化的基本概念 了解蛋白质分子设计的分类，掌握蛋白质分子设计的基本流程  掌握酶分子定向进化的基本策略和基本方法  掌握酶突变基因的基本筛选技术  了解酶分子定向进化的应用