蛋白质

蛋白质是人体所需的有机大分子，在人体中发挥着重要的作用，它们参与了人体的各种生理功能和生化反应，包括维持免疫系统、构建和修复组织、调节代谢、运输氧气和营养物质等。

蛋白质

• 功能分类
  • 受体蛋白：
    • 接受和传递信息
  • 结构蛋白
    • 大多不溶性纤维状蛋白质：a-角蛋白，胶原蛋白
  • 贮存蛋白
    • 卵清蛋白提供氮源
  • 调节蛋白
    • 激素：调节
    • 转录因子和基因调节蛋白：参与基因表达调控题
  • 运动蛋白
    • 高等动物肌肉主要成分，肌肉收缩靠肌球蛋白和肌动蛋白，细胞器的移动通过细胞骨架的蛋白质
  • 酶
    • 催化活性，种类最多，特异性
  • 转运蛋白
    • 一类存在于体液：血红蛋白，血清蛋白
    • 另一类为膜转运蛋白：可形成通道
  • 防御蛋白和毒蛋白
    • 抗体，凝血酶，抗冻蛋白；毒蛋白给动物或植物或细菌起保护作用 主题
  • 支架蛋白
    • 蛋白质装配成一个复合体：锚定蛋白（导向蛋白）例——SH2与含有磷酸化酪氨酸残基的蛋白质结合，SH3与富含脯氨酸残基的蛋白质结合
  • 异常功能蛋白
    • 节肢弹性蛋白（昆虫翅膀），应乐果甜蛋白（人工增甜）
• 氨基酸
  • 氨基酸重要性质
    • 一般物理性质
      • a-氨基酸为无色晶体，不同氨基酸其晶体形状不相同
      • 氨基酸熔点一般在 200 – 300 ℃
      • 氨基酸溶解度差异很大
      • 不同的氨基酸具有不同的味道
    • 酸碱性质
      • 氨基酸的两性解离性质及等电点——当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点（ipI）
    • 光学性质
      • 1、氨基酸的光学活性与立体化学—— 除甘氨酸外，所有天然α-氨基酸都有不对称碳原子，因此所有天然氨基酸都具有旋光性（蛋白质经酸水解或酶促水解得到的都是L-型氨基酸）
      • 2、氨基酸的紫外吸收光谱——参与组成蛋白质的20多种氨基酸在可见光区都没有光吸收，在红外区和远紫外区（l < 200 nm）都有光吸收； 在近紫外区（200 ~ 400 nm）只有芳香族氨基酸有吸收光的能力
      • 3、氨基酸的核磁共振波谱—— 当置于强磁场的两极之间时，核会采取特定的取向。核取向的结果是使得自己的小磁场与外磁场平行或反平行，这两种取向的核能量是不同的，平行取向能量较低，否则反之。 对已采取特定取向的核，用合适频率的电磁辐射照射，则会发生能量吸收，从低能态“自旋翻转”成高能态。 当发生这种自旋翻转时，称此核与外加磁场共振，发生的能量吸收称为共振吸收，因此得名为“核磁共振
    • 酶水解
      • 不消旋
      • 水解不彻底，耗时长
    • 碱水解
      • 有消旋
      • 得到 L-和D-氨基酸混合物：优点色氨酸稳定，缺点：其他被破坏
    • 酸水解
      • 不引起消旋
      • 得到 L-氨基酸：缺点色氨酸破坏其他都一定程度破坏
    • 分类与结构
      • 非极性R基团
        • Ala 丙氨酸
        • Val 缬氨酸
        • Leu 亮氨酸
        • Ile 异亮氨酸
        • Phe 苯丙氨酸
        • Trp 色氨酸
        • Met 甲硫氨酸
        • Pro 脯氨酸
      • 极性不带电荷侧链氨基酸
        • Gly 甘氨酸
        • Ser 丝氨酸
        • Thr 苏氨酸
        • Cys 半胱氨酸
        • Tyr 酪氨酸
        • Asn 天冬酰胺
        • GIn 谷氨酰胺
      • 极性带电荷侧链氨基酸
        • 带正电荷
          • Arg 精氨酸 R
          • Lys 赖氨酸 K
          • His 组氨酸 H
        • 带负电荷
          • Asp 天冬氨酸 D
          • Glu 谷氨酸 E
      • 侧链基团化学结构分类
        • 脂肪族（中性 含羟基 酸性 碱性）
        • 杂环
        • 芳香族
      • 营养学分类
        • 必需氨基酸：Lys Trp Phe Val Met Leu Ile Thr (半必需：Arg His)
        • 非必需氨基酸
      • 不常见氨基酸
        • 硒代半胱氨酸：磷酰化、甲基化、乙酰化、腺苷酰化、ADP-核糖化
      • 非蛋白质氨基酸和氨基酸衍生物
        • r-氨基丁酸(GABA)——神经递质
• 性质
  • 1.两性解离性质及等电点
    • 氨基酸在水溶液中或晶体状态时占优势的分子形式是两性离子（两性电解质性质可作氨基酸缓冲液）氨基酸所带净电荷为零，在电场中，不向任何一极移动为等电点
  • 2.蛋白质的胶体性质
  • 3.蛋白质的沉淀
  • 4.蛋白质的变性与复性
  • 5.蛋白质的紫外吸收特性
    • 测定范围 0.1～0.5mg/ml
  • 6.蛋白质呈色反应：
    • 1、水合茚三酮反应：NH2末端的氨基酸残基也能与茚三酮发生定量反应，生成有色物质，可用于蛋白质的定性、定量分析
    • 2.酚试剂反应：蛋白质可以与酚制剂（如Folin酚）发生反应生成蓝紫色化合物，可以用于蛋白质的精确定量分析。2，4-二硝基氟苯（FDNB）呈黄色（Sanger法）
    • 3.双缩脲反应
      • 是肽与蛋白质所特有、而氨基酸则没有的一个颜色反应。含有两个或两个以上肽键的化合物，与CuSO4碱性溶液都能发生双缩脲反应而生成紫红色或蓝紫色的复合物，可用于测定蛋白质的含量。
• 蛋白质结构
  • 基本
    • 蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。在蛋白质中，多肽链折叠形成基本：特殊的形状（构象，conformation） 在结构中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列决定。
  • 一级结构
    • 指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。在基因一级结构编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的。“氨基酸残基”——存在于肽中的氨基酸不再是完整的氨基酸分子。
  • 二级结构
    • 肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折二级结构叠而形成的局部空间结构，是蛋白质结构的构象单元——a-螺旋 （a-helix） b-折叠（b-pleated sheet） b-转角（b-turn） 无规则卷曲（non-regular coil）
  • 超二级结构
    • 特别是球状蛋白质中，由若干相邻的二级结构单元（即a-螺旋、b-折叠片和b-转角等）彼此相互作用组合在一起，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件单元，称超二级结构。
  • 球状蛋白质的三级结构
    • 指球状蛋白质的多肽链在二级结构的基础上，通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠，借助次级键维系使α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲等二级结构相互配置而形成特定的构象。三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的重新排布
  • 四级结构
    • 指由相同或不同的称作亚基（subunit）的亚单位按照一定排布方式缔合而成的蛋白质结构，维持四级结构稳定的作用力是疏水键、离子键、氢键、范德华力——优势：增强结构稳定性；提高遗传经济性和效率；使催化剂基团汇集在一起；具有协同性和别构效应
  • 名词
    • 结构域——独立的结构单位、独立的功能单位和独立的折叠单位名词：
• 研究构象的方法
  • 1、晶体构象的测定
    • X 射线衍射法
  • 2、溶液构象的测定
    • 紫外差光谱
    • 荧光和荧光偏振
    • 圆二色性（CD）
    • 核磁共振 （NMR）
• 分离和纯化
  • 蛋白质纯化的总目标
    • 是增加制品的纯度或比活，以增加单位蛋白质重量中所需蛋白蛋白质纯化的总目标质的含量或生物活性
      • 种子材料：去壳、去种皮、脱脂（破细胞）
      • 动物材料：剔除结缔组织及脂肪组织；
  • 动物组织或细胞
    • 电动捣碎机、匀浆器、超声波处理
  • 植物组织和细胞
    • 存在细胞壁（纤维素、果胶等），利用石英砂、玻璃粉 以及适当的提取液研磨，或用纤维素酶处理
  • 细菌细胞
    • 1.超声震荡、研磨、溶菌酶处理
    • 2、粗分级分离：常用方法：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离——特点：简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液（蛋白质溶液浓缩方法：超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥、聚乙二醇）
    • 3、细分级分离
      • 1.层析法：包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等
      • 2.电泳法：包括区带电泳、等电聚焦等(特点：规模较小，但分辨率很高)
      • 3.利用选择性吸附的纯化方法:典型的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭等。
        • (运用实例1、羟磷灰石层析：用于选择性除去DNA2、疏水作用层析：高效蛋白质分离纯化方法)
      • 4.利用不同蛋白质表面所存在的疏水性氨基酸残基的数量的不同
      • 5.利用对配体的特异生物学亲和力
• 蛋白质含量测定和纯度鉴定
  • 常用方法
    • 1.双缩脲法——方便但不精确；
    • 2.Folin酚试剂法（Lowry法）——蛋白质含量测定的标准方法
    • 3.紫外吸收法——方便但不太精确，样品可以回收4.染料结合法（Bradford法）——考马斯亮蓝染色，重复性好，可精确到微克级5.胶体金测定法——最为精确，可达到纳克级
    • 4.高磁场NMR可用来测定蛋白质的三维结构
    • 5.凯式定氮法：现在不用，因为和蛋白质氨基酸含氮量一样的检测不出来
    • 6.紫外吸收法：不准确但样品可回收
    • 7.胶体金测定法：纳克级——最精确
    • 8.染料结合法：考乌斯亮蓝，重复性好，精度高-微克级
  • 特定蛋白质含量的测定
    • 对于具有酶、激素活性的蛋白质，可以通过测定其酶活性或者是激素活性来测定它们在混合物中的含量；没有活性用抗原——抗体相互作用
  • 蛋白质纯化程度的判断
    • 特定蛋白成分的含量（一般以活力为单位）与总蛋白量（重量单位）之比为指标——以酶为例，常用的指标为酶的比活力（或称酶的比活），即每毫克蛋白中所含有的酶活力单位数
  • 蛋白质纯度的鉴定
    • 电泳法：如IEF、PAGE、CE-单一条带/峰;离心沉降——单一区带；HPLC——单一对称峰；溶解度分析——溶解蛋白量对加入蛋白量作图，得到单折点直线；N-末端残基分析——对纯的单一肽链蛋白而言，只有一个N-末端氨基酸