导图社区 化学生物学 第一章蛋白质
这是一篇关于化学生物学 第一章蛋白质思维导图，包含蛋白质概述、蛋白质的基本单位、蛋白质的一级结构等。
络合滴定法是以络合反应为基础的滴定分析方法称。它主要以氨羧络合剂为滴定剂，这些氨羧络合剂对许多金属有很强的络合能力。
络合滴定法，以洛合反应为基础的滴定分析方法称为洛合滴定法。详细总结了溶液中各级络合物型体的分布，络合滴定的方法和应用。
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蛋白质
一、蛋白质概述
由许多不同的氨基酸按照一定顺序通过酰胺键（肽键）缩合而成的一条或多条多肽链，有较稳定的构象，并具有一定生物功能的大分子。
分子量估算公式：110*氨基酸数
蛋白质的生物学功能
作为信号分子
保持体液平衡
运输载体
抗体（防御功能）
提供能量、合成脂肪和葡萄糖
具有催化作用（蛋白酶）
蛋白质的元素组成
N是特征性元素，平均为16％
蛋白质含量=蛋白质含N量/16％=蛋白质含N量*6.25
二、蛋白质的基本单位
氨基酸结构通式
不同点：①甘氨酸不含手性碳原子，其他均含 ②脯氨酸为α-亚氨基酸，其他均为α-氨基酸
氨基酸的分类和结构
看附件
氨基酸的理化性质
物理性质
白色晶体（黄色的是盐酸盐）
溶于水、稀酸、稀碱，不溶于乙醇乙醚
离子晶体，熔点在200-300℃
旋光性：除了甘氨酸之外都有手性碳原子
光学性质
苯丙氨酸（Phe）吸收波259nm 酪氨酸（Tyr）吸收波278nm 色氨酸（Trp）吸收波279nm
氨基酸的解离性质及等电点
各个氨基酸的等电点
化学性质
α-氨基
甲醛
当氨基酸溶液中加入过量的甲醛时，用标准氢氧化钠滴定，滴定终点由pH12→pH9，可用酚酞指示剂
亚硝酸（伯胺基） 范斯莱克（Van Slyke）法测定氨基酸
氮气一半来自氨基酸，一半来自亚硝酸
含亚氨酸的脯氨酸不能与亚硝酸反应
酰基化反应
氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱溶液中发生作用时，氨基即被酰基化。酰化试剂常用作氨基的保护剂 丹磺酰氯被用于多肽链 N末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定（荧光！）
烃基化反应
氨基酸氨基的一个H原子可被烃基(包括环烃及其衍生物）取代 a.sanger 反应:2,4-二硝基氟苯(DNFB/FDNB)在弱碱条件下和氨基反应生成DNP-氯基酸（黄色油状） b.Edman 反应:苯异硫氰酸酯(PITC)在弱碱的条件下生成 PTH 的行生物
西佛碱
氨基酸的氨基可以与醛酮反应生成西佛碱
α-羧基
成盐反应
氨基酸的碱金属盐能溶于水，重金属盐不溶于水
成酯反应
成酰氯反应
氨基酸的氨基被保护后，羧基同二甲亚砜或五氯化磷生成酰氯
叠氮反应
脱羧反应
蛋白质腐败过程发生，氨基酸脱羧生成胺和二氧化碳
α-氨基+α羧基
茚三酮反应
作用生成蓝紫色物质，反应可用分光光度法在 570nm处定性定量测定; 脯氨酸和羟脯氨酸直接生成黄色产物，最大光吸收为 440nm
成肽反应
产物具有方向性
侧链
苯环
与浓硝酸反应生成黄色物质
酚基（酪氨酸）
与硝酸反应呈红色 与还原磷钼酸、磷钨酸成钼蓝和钨蓝 与重氮化合物结合生成橘黄色物质
吲哚基（色氨酸）
在温和条件下可被N-代琥珀酰亚胺氧化
胍基（精氨酸）
在碱性溶液中与α-萘酚和次溴酸盐作用生成红色物质，在羟胺缓冲溶液中反应可逆转
甲硫基
亲核基团，与烃化试剂容易形成锍盐
巯基（半胱氨酸）
在微碱性pH下发生解离形成的硫醇阴离子，阴离子能与卤化烷例如碘乙酸、碘乙酰胺、甲基碘等迅速反应，生成相应的稳定烷基衍生物:与金属离子络合;容易被氧化
氨基酸的用途
医药
化工
食品
农业
化妆品工业
氨基酸的分离与分析
柱层析
纸层析
离子交换层析法
分离速度主要取决于静电吸引，其次取决于疏水作用 极性基团相同的情况下，分子量小的先洗下来
阳离子交换树脂（酸性）：洗脱顺序酸性＞中性＞碱性
阴离子交换树脂（碱性）：洗脱顺序相反
电泳法
当AA处于等电点时，外加电场中不会移动
当介质pH小于AA等电点时，AA带正电荷，在电场中向阴极移动
当介质pH大于AA等点点时，相反
等电点沉淀法
越接近AA的等电点，该AA的溶解度越小，越容易沉淀
三、蛋白质的一级结构
一级结构
一级结构包括组成蛋白质的氨基酸数目、种类、排列顺序、多肽链数目，以及多肽链内或链间的二硫键的数目和位置
一级结构的测定
基本策略：片段重叠法和氨基酸顺序直测法
基本步骤
①测定蛋白质分子中多肽链的数目
通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质摩尔数之间的关系
②拆分蛋白质的多肽链，断开多肽链间、链内二硫键
肽链间非共价键结合：温和条件下用8mol/L尿素或者6mol/L盐酸胍或高浓度盐酸
肽链间共价键结合：氧化剂（氧化酸）或还原剂（巯基化合物）
用烷基化试剂（碘乙酸）保护还原生成的半胱氨酸残基上的-SH，防止氧化
③分析每一条多肽链的氨基酸组成
④分析每一条多肽链的氨基酸顺序
N端氨基酸测定
二硝基氟苯（DNFB/FDNB)
丹磺酰氯(DNS)
苯异硫氰酸酯(PITC)
氨肽酶
C端氨基酸测定
肼解法
羧肽酶法
羧肽酶A：水解除Pro、Arg和Lys以外的所有C端氨基酸残基
羧肽酶B：只能水解Arg和Lys的C端氨基酸残基
羧肽酶γ：可作用于任何一个C端残疾
还原法
硼氢化钠
多肽链的裂解方法
化学法
溴化氰法
特异切割Met的羧基形成的肽键
羟胺法
pH=9时专一性切割Asn-Gly之间的肽键
酶解法
胰蛋白酶
只断裂Lys、Arg的羧基形成的肽键
胰凝乳蛋白酶
Phe、Trp、Tyr（水解速度快）/Leu、Met、His（次之）
胃蛋白酶
疏水性氨基酸残基（pH=2）
嗜热菌蛋白酶
⑤确定半胱氨酸残基间形成二硫键的位置
一般选用胃蛋白酶水解蛋白质，专一性低，切点多，生成含有二硫键的肽键较少，pH低，防止二硫键发生交换反应。 对角线电泳法分离
分离纯化
分离方法
分子大小
离心沉降法
透析法
凝胶色谱法
溶解度不同
盐溶
盐析
有机溶剂
温度
电荷性质
离子交换色谱法
子主题
吸附性质
吸附层析法
亲和层析法
离子交换层析
疏水层析
六、蛋白质的重要性质
蛋白质两性解离性质和电泳现象
蛋白质等电点
胶体性质与沉淀
分散相质点在1-100nm之间，属于胶体溶液
在水溶液中保持稳定的三个条件
分散相质点在1-100nm范围内，动力学稳定
蛋白质表面能带有同种电荷、互相排斥，不易聚集成大颗粒沉淀
表面能与水形成水化层，相互之间不容易靠拢而聚集
沉淀方式
高浓度中性盐（盐析、盐溶）
氯化钠、硫酸铵、硫酸钠
可逆
酸碱（等电点沉淀）
有机溶剂沉淀
重金属盐类沉淀
容易引起蛋白质变性
生物碱试剂沉淀
加热变性沉淀
最完全、最迅速
蛋白质凝固
变性蛋白质互相凝聚或相互穿插在一起的现象
本质是蛋白质变性之后的一种不可逆发展结果
变性与复性
蛋白质变性：物理或化学因素使蛋白质分子使蛋白质分子原有的特定的空间结构发生改变，肽链从紧密有序的结构变为松散无序的结构，引起蛋白质理化性质的变化
蛋白质复性：除去变性因素后，有的变性蛋白质又可恢复天然构象和生物活性
变性因素
化学
酸、碱、有机溶剂、蛋白质变性剂（尿素、盐酸胍）、重金属盐
物理
加热，紫外线，X射线、超声波、剧烈震荡
特征
次级键断裂，构想破坏，不涉及共价键，一级结构不变
活性丧失或部分丧失
溶解度降低，粘度增加
紫外吸收
280nm特征吸收
呈色反应
双缩脲反应
红紫色络合物
Folin-酚法
深蓝色
考马斯亮蓝G-250
488nm→595nm
五、蛋白质结构与功能的关系
蛋白质复杂的组成和结构是其多种多样生物学功能的基础；而蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映
一级结构与功能的关系
同源蛋白：不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质，其氨基酸序列具有明显的相似性，即系列同源性。
细胞色素C
四、蛋白质的三维结构
包括
二级结构
结构域
超二级结构
三级结构
四级结构
蛋白质三维结构测定方法
X射线衍射法
紫外差光谱
荧光和荧光偏振
圆二色性
核磁共振
冷冻电子显微镜
稳定蛋白质三维结构的作用力
弱相互作用/非共价作用力
氢键
主链上羰基氧和酰胺氢之前形成，是稳定二级结构的主要作用力，具有方向性包和饱和性
范德华力
定向效应
诱导效应
分散效应
疏水作用
疏水基团或侧链出自避开水的需要而被迫接近，疏水基团的聚集是一个有序化的过程，熵减
离子键
共价作用力
二硫键
蛋白质的二级结构
多肽链自身盘旋折叠形成的在以为方向上由氢键维系的有规则结构
α-螺旋
重复结构
稳定螺旋的主要作用力是氢键
链内的-NH和-CO之间形成的氢键
蛋白质中的α-螺旋几乎都是右旋的，手性结构，有旋光性
每圈螺旋有3.6个AA，上升0.53nm，每个残基旋转100°，上升0.15nm
由氢键封闭的环是13元环，α螺旋也叫做
β-折叠
主要作用力是氢键
相邻肽段主链上所有的-NH和-CO形成的氢键
沿纸条方向折叠成锯齿状
平行式与反平行式
β-转角
无规结构
构型
化合物分子中原子和基团在空间的取向，构型的改变涉及共价键的形成与破坏，但与氢键无关
构象
化合物分子中沿共价单键旋转而产生的不同空间排列，构象的改变不涉及非共价键的形成与破坏
蛋白质的超二级结构和结构域
蛋白质特别是球状蛋白质分子中由若干相邻的二级结构的元件组合在一起，彼此相互作用，形成种类不多的、有规则的二级结构组合体，在多种蛋白质中充当三级结构的构件
组合形式
αα
βαβ
ββ
β-迂回
回形拓扑结构
球状蛋白质的独立折叠单位
蛋白质的三级结构
球状蛋白
蛋白质的四级结构
寡聚蛋白和亚基
寡居蛋白：两个或两个以上球状蛋白质通过非共价键结合的多聚体
亚基：寡聚蛋白中每个独立的球状蛋白质
亚基种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中空间排布和亚基间相互作用
四级结构特点
亚基单独存在时没有完整生物活性
亚基之间以非共价键结合
对称性
结构和功能上的优越性
增强了结构稳定性
提高了遗传经济性和效率
催化剂汇集在一起
协同性和别构效应
别构效应：结合在蛋白质分子特定部位上的配体对其它部位产生影响
维持蛋白质结构的主要作用力
一级结构：肽键、二硫键
二级结构：氢键
三级结构：氢键、疏水作用
四级结构：氢键、疏水作用、离子键、范德华力
测量蛋白质浓度： 双缩脲法，Folin-酚法，紫外吸收法，凯氏定氮法，考马斯亮蓝法、茚三酮法、胶体金测定法 双缩脲、Folin-酚需要完整的肽键 茚三酮需要一个氨基酸游离氨基 紫外吸收主要测酪氨酸，色氨酸残基 胶体金是灵敏度最高的
肽键和氢键是决定蛋白质构象的主要因素 蛋白构象疾病/蛋白质变性
①小肠是蛋白质消化的主要部位 ②肠道细菌对没有被消化的蛋白质或者没有被吸收的蛋白质消化产物所引起的分解作用叫做蛋白质的腐败作用 ③有害物质有利物质都有
所以可用紫外分光光度计测定蛋白质含量 不是只在这里有吸收峰，而是在此处更强 大致可以认为是在280nm处
三聚氰胺→三鹿奶粉事件
