响应面优化大豆分离蛋白的提取工艺及纯化

这是一篇关于响应面优化大豆分离蛋白的提取工艺及纯化的思维导图，主要内容包括：参考文献，材料与方法，摘要，结论，结果与分析，前言（选题目的及意义）。

响应面优化大豆分离蛋白的提取工艺及纯化

• 摘要
• 前言（选题目的及意义）
• 材料与方法
  • 材料、试剂与仪器
    • 材料
      • 大豆，市售
    • 仪器
      • 752型分光光度计；UV-265 型紫外可见记录光谱仪；PHS-3C 型 pH计；SCIENTZ-18N 冷冻干燥机
    • 试剂
      • β-巯基乙醇、考马斯亮蓝G-250、丙烯酰胺、SDS
  • 实验方法/操作
    • 样品制备
    • 大豆分离蛋白的提取
      • 碱提酸沉
        • 在室温下，将豆粕按1:15比例与水混合，在pH8.0环境下搅拌1小时以溶解蛋白质。随后通过3000r/min离心15分钟分离浆渣并丢弃沉淀物。调整上清液至pH4.5使其静置沉淀30分钟（利用碱性转酸性条件使大豆蛋白沉淀）。接着再次离心25分钟收集沉淀，并用去离子水洗涤三次后将其溶解于五倍体积的蒸馏水中。最终将溶液pH调至7.5，进行第三次高速离心（30000r/min，25min），去除上清液后所得沉淀即为初步提取的大豆分离蛋白粗品。
    • 蛋白质提取率的计算（以干样计算）
      • 蛋白质提取率＝提取大豆蛋白的含量 / 大豆 中蛋白质的含量 ×100%
    • 标准曲线的建立
      • 样品蛋白质含量测定
        • 配制一系列浓度已知的标准蛋白质液，与考马斯亮蓝染料反应测定吸光度绘制标准曲线。处理待测蛋白样品至适宜浓度，在稳定条件下使其与染料结合孵育。于595nm波长测量各管吸光度，包括空白对照及样品。利用所得吸光度值参照标准曲线计算出样品中蛋白质浓度。操作中确保条件恒定，注意光照、温度影响以及不同蛋白质类型对方法的敏感性差异。
    • 单因素试验
      • 浸提 pH 8
      • 料液比1：14g/mL
      • 浸提温度50℃
      • 浸提时间60min
      • 考察上述条件的基础上进行响应面优化试验
    • 响应面试验
      • 三水平四因素
    • 凝胶过滤
      • 将琼脂糖凝胶湿法制备填入层析柱，并用1mol/L NaCl的PBS缓冲液（该缓冲液由50mmol/L KH2PO4-Na2HPO4调配而成，pH值为7.6）进行平衡处理。样品需在PBS缓冲液中配制，离心去除上清液后，确保蛋白质溶液浓度低于10mg/mL，因为实验多次证明，这个浓度能实现高吸附率和较短的平衡时间。接下来将样品上柱，使用磷酸盐缓冲液做线性梯度洗脱，设定流速为1.0mL/min，每6mL收集一管，采用紫外检测器在280nm波长处进行检测。最后对收集的样品进行冷冻干燥处理，并通过SDS-PAGE方法进行分析。
    • SDS-PAGE 检测
      • • 根据Kasran等人的方法［15］，对经过凝胶过滤的大豆分离蛋白进行了SDS-PAGE分析，其中分离胶占比为15%，浓缩胶占比为5%。
        • 选用的相对分子质量标准蛋白包括：磷酸化酶（97400 Da）、牛血清白蛋白（66200 Da）、兔肌动蛋白（43000 Da）、牛碳酸酐酶（31000 Da）、胰蛋白酶抑制剂（20100 Da）以及鸡蛋清溶菌酶（14400 Da）。
• 结果与分析
  • 单因素试验结果
    • 浸提 pH 8对提取率的影响
    • 料液比1：14g/mL对提取率的影响
    • 浸提温度50℃ 对提取率的影响
    • 浸提时间60min对提取率的影响
  • 响应面优化试验
    • 响应面优化试验设计及结果
      • 由表可知: 模型 F 值为 5.65、P ＜ 0． 0024， 表明模型 显 著，拟 合 良 好; 失 拟 项 P = 0．0737 ＞ 0． 05，表明该模型无显著差异，误差小，且具有较高 的拟合度。此外，模型的 Ｒ2 达到 0．8682，可解释 86.62 % 的响应值变化，表明预测结果与实际结果 高度一致。Ｒ2adj = 0．7145说明有 71.45 % 的大豆分离蛋白提取条件可以进行数据分析。各因素对大豆分离蛋白提取的影响程度为 A ＞ C ＞ D>B，即浸提pH>浸提温度>浸提时间>料液比。A、C 影响极 显著( P ＜ 0． 01) ，D、A2、C2影响显著( P ＜ 0． 05) ，其他项则 无显著影响。
    • 验证实验
      • 通过响应面分析得到最佳提取工艺条件为浸提 pH 9.00、料液比1：15g/mL、浸提温度57.00℃、浸提时间64.01min 。为便于实际操作，将最佳提取工艺条件 调整为 浸提 pH 9、料液比1：15g/mL、浸提温度57℃、浸提时间64min 。在此条件下进行验证实验，测得平均提取率为4.75，与 预 测 值 接 近，RSD 0.98%说 明 响 应 面 试 验 结 果 可靠。
  • 凝胶过滤图谱
  • SDS-PAGE 检测
• 结论
  • 对豆粕中大豆分离蛋白提取工艺条件进行单因素试验和响应面优化试验，得到的最佳工艺条件为：浸提 pH 9、料液比1：15g/mL、浸提温度57℃、浸提时间64min。在最佳条件下，大豆分离蛋 白的提取率为 82.58%，提取物中蛋白质含量为 92.65%。经过凝胶层析，获得的目标蛋白图谱呈现单一洗 脱峰，纯化后的 SPI 其总蛋白含量达到 98.56%。 再通过 SDS-PAGE 验证，电泳图谱只存在少量杂带，说明蛋白已具有较高纯度，可以满足后续 科研试验的需要。
• 参考文献
  • [1]韩晶,张清安,杨晓英,等.豆渣中蛋白质的响应面法优化超声辅助提取[J].农产品加工（下）,2015(9):4-8.
  • [2]陆晨,邹雨虹,张士康,等.响应面法优化超声辅助提取茶渣蛋白质的工艺条件[J].食品与生物技术学报,2012(3):319-325.
  • [3]陆晨,邹雨虹,张士康,等.响应面法优化超声辅助提取茶渣蛋白质的工艺条件[J].食品与生物技术学报,2012(3):319-325.
  • [4]郎佳雪,刘畅,赵淼,等.响应面法优化碱性蛋白酶水解豆渣蛋白质的研究[J].食品研究与开发,2022,43(3):129-135.
  • [5]郭兴凤,张娟娟,马宇翔,等.响应面法优化中性蛋白酶提取米渣中蛋白质的研究[J].河南工业大学学报：自然科学版,2008,29(6):13-17.
  • [7]安传相,毕远林,裴璞花,等.响应面法对核桃粕中蛋白质提取工艺的优化[J].食品研究与开发,2017,38(22):38-43.
  • [8]高丽,蔡枭峰,李静.大豆分离蛋白的提取、纯化及鉴定[J].中国食品添加剂,2022,33(11):136-141. DOI:10.19804/j.issn1006-2513.2022.11.018.
  • [9]Kasran M，Cui S W，Goff H D. Emulsifying properties of soy whey protein isolate-fenugreek gum conjugates in oil-in-water emulsion model system［J］. Food Hydrocolloids， 2013，30（2）：691-697.
• 小队成员：敖建