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生物必修一
基因工程与蛋白质工程
基因工程知识点
概念
按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
注意
基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
基因工程的诞生
理论基础
DNA是遗传物质
DNA分子的双螺旋结构和半保留复制
遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式
技术基础
限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割
DNA连接酶的发现与DNA片段的连接
基因工程载体的构建与应用
理论上的三大发现
发现了
遗传物质——DNA
1944年，艾弗里（O.T.Avery）的肺炎双球菌转化实验
揭示了
遗传物质的分子机制
1953年，沃森（J.D.Watson）和克里克（F.Crick）的DNA双螺旋结构模型、半保留复制图，获1958年诺贝尔奖
确立了
遗传信息的传递方式
方式
以密码形式传递
1963年，美国尼伦伯格（M.W.Nirenberg）和马太（H.Matthaei）
结果
确立了遗传信息以密码形式传递
破译了编码氨基酸的遗传密码(3个核苷酸=1个密码子=1个aa)
技术上的三大突破
世界上第一个重组DNA实验
实现不同来源DNA的体外重组
1972年斯坦福大学化学家伯格（P.Berg）
过程
借助内切酶和连接酶将猴病毒SV40的DNA和大肠杆菌λ噬菌体的DNA在试管中连接在了一起
第一次成功地实现了DNA的体外重组
第一个基因克隆实验
重组DNA表达实验，是世界上第一个基因工程实验
1973年美国斯坦福大学医学院遗传学家科恩（S.Cohen）
将体外构建的含有四环素和卡那霉素抗性基因的重组质粒导入大肠杆菌
获得了具有双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。是基因工程诞生的标志。
第一个真核基因在原核生物中的表达
第一次实现了异源真核基因在原核生物中的表达
1974年，科恩（S.Cohen）和博耶（H.Boyer）
将非洲爪蟾编码核糖体基因的DNA片断同pSC101质粒重组，并导入大肠杆菌细胞
表明动物基因已进入大肠杆菌并转录出相应的mRNA产物，第一次实现了异源真核基因在原核生物中的表达。
DNA基因工程至少需要三种工具
分子手术刀
限制性核酸内切酶（限制酶）
来源
主要是从原核生物中分离纯化出来的。
功能
能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：粘性末端和平末端。
分子缝合针
DNA连接酶
种类
E·coliDNA连接酶
大肠杆菌
特点
只能缝合具有互补粘性末端的双链DNA片段
T4DNA连接酶
T4噬菌体
可以缝合双链DNA片段互补的黏性末端
可以缝合双链DNA片段的平末端
比较
相同点
都缝合磷酸二酯键
区别
E·coli DNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间的磷酸二酯键连接起来；
而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
与DNA聚合酶作用的异同
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
作用
将双链 DNA 片段“缝合” 起来, 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
分子运输车
基因进入受体细胞的载体
载体具备的条件
①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
最常用的载体
质粒
一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外
具有自我复制能力的双链环状DNA分子
其它载体
噬菌体的衍生物、动植物病毒
DNA 的粗提取与鉴定
原理
DNA、 RNA、 蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面有差异
①DNA 不溶于酒精, 某些蛋白质溶于酒精, 分离 DNA 和蛋白质
②DNA 能溶于 2mol/L 的 NaCl 溶液
DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色
实验步骤(以洋葱为例)
取材和研磨
称取约30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨。
过滤或离心取上清液
方法
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液
可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500 r/min的转速下离心5 min，再取上清液放入烧杯中。
预冷酒精析出DNA并收集DNA
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3 min（溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA）
注意：玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分
将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r/min的转速下离心5 min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干
NaCl溶液溶解DNA并鉴定
取两支20 mL的试管，各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL。
将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。
向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。
混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min。
待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
加入沉淀物或丝状物的试管中溶液变成蓝色
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
目的基因
编码蛋白质的结构基因
原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。
人工合成目的基因常用方法有反转录法和化学合成法
PCR技术扩增目的基因
DNA双链复制
过程及目的
a：加热至90-95℃
DNA解链
b：冷却到55-60℃
引物结合到互补DNA链
c：加热至70-75℃
热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
基因表达载体的构建
目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
组成
目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
启动子
是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端
RNA聚合酶识别和结合的部位
能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质
终止子
也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。
标记基因
是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
常用的标记基因
抗生素基因
将目的基因导入受体细胞
转化
是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
常用的转化方法
将目的基因导入植物细胞
采用最多的方法
农杆菌转化法
其次
基因枪法和 花粉管通道法等
将目的基因导入动物细胞
最常用的方法
显微注射技术
此方法的受体细胞多是受精卵
将目的基因导入微生物细胞
Ca2＋处理细胞
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
受体细胞
原核生物(使用最广泛的是大肠杆菌)
重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
目的基因的检测与鉴定
1.首先要检测 转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
采用 DNA分子杂交技术
2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA
采用标记的目的基因作探针与mRNA杂交
3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质
从转基因生物中提取蛋白质，用相应抗体进行抗原－抗体杂交
4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定
如：转基因抗虫植物是否出现抗虫性状
基因工程的应用
植物基因工程
抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。
动物基因工程
提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。
基因治疗
把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。
基因工程在农牧业方面的应用
发展
(1) 农牧业
1996-2017 年, 全世界转基因作物的种植面积增加了一百多倍, 美国是世界上转基
因作物种植面积最大的国家。 2017 年, 我国转基因作物种植面积居世界第八位。
(2) 动物
第一种用于食用的转基因动物——转基因大西洋鲑在美国获得批准上市。
基因工程在医药卫生领域的应用
生产药物
(1) 常见的药物
细胞因子、 抗体、 疫苗和激素等。
注意：我国生产的重组人干扰素、 血小板生成素、 促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物均已投放市场。
(2) 批量生产药物
乳腺(房) 生物反应器
①目的基因
药用蛋白基因
②启动子
乳腺中特异性表达的基因的启动子
③受体细胞
受精卵
移植器官
在器官供体的基因组中导入某种调节因子, 以抑制抗原决定基因的表达
或设法除去抗原决定基因, 培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官
培养乳腺生物反应器转基因动物时为什么要选用乳腺中特异性表达的基因的启动子?
提示
乳腺生物反应器通过分泌的乳汁提取相应的基因表达的产品, 乳腺中特异性表达的启动子可让目的基因在乳腺细胞中表达。
基因工程在食品工业方面的应用
氨基酸
利用转基因生物合成阿斯巴甜的原料——天冬氨酸和苯丙氨酸
酶
利用转基因生物生产奶酪的凝乳酶
利用转基因生物加工转化糖浆的淀粉酶
利用转基因生物加工烘烤食品、 制造生物能源的脂酶等
维生素
蛋白质工程
蛋白质工程的概念
基础
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础
途径
改造或合成基因
对象
基因
对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活需求
蛋白质工程的地位
在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程
蛋白质工程崛起的缘由
(1)基因工程的实质
将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。
(2)蛋白质工程崛起的缘由
①基因工程的不足
基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。
②天然蛋白质的不足
天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
蛋白质工程的基本原理
(1)蛋白质工程目标
根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
(2)蛋白质工程的实质
要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。
(3)天然蛋白质的合成过程
(4)蛋白质工程基本思路
从预期蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
(5)蛋白质工程流程图
蛋白质工程的应用
(1)医药工业方面
①科学家通过对胰岛素的改造，已使其成为速效型药品
②对干扰素的改造，使其在一定条件下可以延长保存时间
③对小鼠单克隆抗体的改造，使其诱发免疫反应的强度降低
(2)其他工业方面
改进酶的性能或开发新的工业用酶。
(3)农业方面
①改造某些参与调控光合作用的酶
以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。
②设计优良微生物农药
通过改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。
蛋白质工程难度很大的原因
蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。
