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蛋白质工程新技术
包含核酸的提取与检测、聚合酶链式反应、蛋白质芯片技术、酵母双杂交技术、吞噬体展示技术、蛋白质分子印迹技术。
编辑于2024-11-05 18:25:04- 蛋白质芯片技术
- 酵母双杂交技术
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蛋白质工程新技术
核酸的提取与检测
步骤
一、核酸的提取与纯化
（一）化学试剂提取法
（1）CTAB法 CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液(0.7mol/LNaC1） 中是可溶的，当降低溶液盐液度到一定程度 (0.3mol/LNaCI)时从溶液中沉淀，通过离心就可将 CTAB 与核酸的复合物同蛋白质、多糖物质分开；然后将 CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加人乙醇使核酸沉淀，CTAB 溶于乙醇。
优点：CTAB 法的最大优点是能很好地去除糖类杂质，对于含糖较高的材料最为适宜
2）SDS 法：其原理是利用高浓度的 SDS（十二烷基硫酸钠》在较高温度（55°C~65°C） 条件下裂解细胞，使染色体离析、蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖沉淀（通常是加人5mol/L 的乙酸钾于冰上保温，在低温条件下乙酸钾与蛋白质及多糖结合成不溶物)。离心除去沉淀后，对上清液申的核酸进行反复抽提去除蛋白质，用乙醇沉淀水相中的核酸。
优点：SDS 法操作简单、温和，也可提取到高分子的 DNA和RNA，但所得产物含糖类杂质较多
(二)离心分离法
①根据样品的质量来进行分离，称为速度区带离心。样品铺在介质的顶部，在离心过程中以不同的速度往下沉降。沉降的速度与样品的质量、密度、离心力的大小、介质的密度以及样品与介质的摩擦力大小有关。离心完成时，不同的样品在离心管中位于不同的区带上。
②根据样品的密度大小不同而进行分离，称为密度梯度离心。密度梯度可以在开始前做好，也可在离心时依靠离心力自己形成密度梯度。后者就是平衡密度梯度离心技术。当样品在具有密度梯度的介质中离心时，样品往上或往下移动，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，当介质的密度与样品的密度相等时，样品停止移动，停留在该介质密度的位置上。
（三）微生物 DNA 的提取
常用的质粒DNA，分离方法有3种：碱裂解法、煮沸法和去污剂裂解法，前两种方法比较剧烈，第三种方法比较温和，一般用来分离大质粒。质粒的提取方法虽多，但不外乎以下3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒 DNA 的分离和纯化
（四）植物细胞核 DNA 的提取
真核细胞破碎有各种手段。物理方式包括超声波法、匀浆法等，这些物理方法容易导致 DNA 链的断裂。为了尽可能地获得大分子的 DNA，一般采用去污剂温和处理法，对于细胞破碎较困难的植物材料，可以辅加蛋白酶区，在酶的存在下共同破碎细胞
(五）RNA 的提取
提取 RNA 的方法很多，但一般都包括 4 个步骤： ①破碎细胞（尤其是植物细胞有较厚的细胞壁保护，研磨不彻底，RNA 提取就无法取得好的结果）； ②使核蛋白复合体充分变性，即使核蛋白迅速与核酸分离； ③抑制内源 RNase 以及容器污染的外源 RNase 的活性： ④将 RNA 与 DNA、蛋白质和多糖分开。
二、核酸的检测与保存
概念:核酸是分子生物学研究的主要实验材料，在进行分子生物学研究中，须对提取出的核酸经常进行检测，并妥善保存，才能保证研究工作的顺利进行。
方法
（一）核酸的检测
(1)紫外光谱分析法：紫外光谱分析法是基于分子内电子跃迁产生的吸收光谱进行分析的一种光学分析方法，紫外光区的波长范围为 10~400nm，其中叉分远紫外区（10~200nm）和近紫外区 (200~400nm）。
（2）荧光分析法：物质的分子吸收光能后发射出波长在紫外、可见（红外）区的茨光光谱，根据其光谱的特征及强度对物质进行定性和定量分析，这种分析方法就是分子茨光分析法。
（二）核酸的保存
影响的关键因素
(1）保存液的酸碱度：由于水稀释电解质可以断裂核酸的氢键，破坏其双螺旋结构，使核酸变性。
(2）保存温度：温度是影响核酸稳定性的重要因素。温度升高会增加核酸的分子内能，对核酸结构稳定性的维持不利
保存方法
一般保存可用浓盐液、NaCl一柠檬酸缓冲液或 0.1mol/L 醋酸缓冲液。 并且 DNA 的液态保存需用一定的盐浓度。对 DNA 来说，在 pH4~11 的范围分子的碱基较稳定，超出此范围 DNA 易变性或降解，低温、稀碱下保存DNA 及低温下保存 RNA 均较稳定。 固态核酸通常在 0摄氏度以下低温干燥保存即可。小分子核酸保存温度还可更低一些
三、核酸的凝胶电泳
概念：琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为支持物，在适当条件下对带电生物大分子进行电冰的技术，主要用于 DNA 分子的分离、纯化和鉴定。DNA 分子在其 等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，由于 DNA 分子的分子 质量差别，电泳后不同大小的 DNA 分子呈现迁移位置的差异，把已知分子质量的标准 DNA 与待测 DNA 同时电泳，比较两者在凝胶板上所星现的区带，就可以鉴定出待测 DNA 的大小。
四、核酸的分子杂交
概念：分子杂交是核酸研究中一项最基本的实验技术。其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的 DNA(或 RNA）片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子杂交双链可以在 DNA 与 DNA 链之间，也可在 RNA 与 DNA 链之间形成。杂交的本质就是在一定条件下使互补核酸链实现复性，再通过变性（加热或碱处理）使双螺旋解开成为单链
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应
定义
聚合酶链式反应是一种快速体外DNA扩增技术
优点：能快速扩增、简便易行和成本低廉，理论上可以扩增任何核酸片段
PCR扩增原理
主要利用DNA双螺旋结构的生物功能：复制和转录
过程
（90°C~95°C）高温变性：使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离，形成单链DNA
（38°C~65°C）低温退火：解除变性条件之后，变性的单链可以重新结合起来，形成双链
（60°C~72°C）中温延伸：从固定延伸起点开始，在聚合酶的作用下会迅速地以旧链为模板，在引物的3'端连续掺入4种dNTP，合成新的DNA互补链
理论上，反复进行变性、退火和延伸循环过程，每循环一次，模板DNA的拷贝数增加一倍，循环n次可得到2n个分子。
聚合酶链式反应(PCR)扩增是一种特定区域的DNA复制，这仍然遵循DNA生物合成的基本规律，其复制方式是以半保留形式进行的。PCR扩增过程中，DNA链的延伸是有方向性的。目前使用的DNA聚合酶，合成DNA的方向都是从5'端到3'端。
DNA扩增的必须材料
DNA模版（template）
DNA聚合酶（DNApolymerase）
DNA引物（primer）
四种dNTP和二价镁离子
聚合酶链式反应体系
反应体系
聚合酶链式反应体系的总体积依实验要求而定。例如，在50uL聚合酶链式反应体系中，加入下列试剂：20pmol上游引物和20pmol下游引物、20mmol/LTris-HCl（pH8.3,20°C）、1.5mmol/L氯化镁、25mmol/LKCl、0.05%去污剂Tween20、100ug/mL 明胶或无核酸酶的牛血清蛋白、50ugmol/LdNTP、2UTaqDNA聚合酶、100~200ngDNA模板，将试剂混匀
反应参数
PCR参数包括循环中三阶段的温度及持续时间控制，以及循环的次数，这在一定程度上影响着聚合酶链式反应的成功与否
通常PCR反应应采取的反应参数
变性温度95°C60s
退火温度38~65°C60s
延伸温度72°C1~2min
循环次数30~35次
DNA变性时间与终延伸时间
为了使模板DNA双链充分打开，开始时模板DNA变性时间要适当延长，一般设预变性94°C，3~5min。一般在扩增反应完成后，PCR产物中可能含有长短不一的DNA分子，都需要一步长时间的延伸反应，成为终延伸，时间要保持在10min左右，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。反应之后，可以放到4°C中保存，以备电泳检测。
蛋白质芯片技术
概念
由固定于不同种类支持介质上的抗原或抗体微阵列组成，阵列中固定分子的位置及组成是已知的，用标记的抗体或抗原与芯片上的探针进行反应，然后通过特定的扫描装置进行检测，结果由计算机分析处理。
原理
蛋白质芯片将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜、载玻片等各种载体上成为检测用的芯片→然后用标记了特定荧光抗体的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上蛋白质互补结合的成分洗去→再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描等技术，测定芯片上各点的荧光强度→通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，从而达到测定各种蛋白质功能的目的。
（注意：首先必须通过一定的方法将蛋白质固定于合适的载体上，同时能够维持蛋白质的天然构象，也就是必须防止其变性以维持其原有特定的生物学活性。）
分类
用途不同分类
蛋白质功能芯片
蛋白质检测芯片
检测方法不同
正相蛋白质检测芯片
反相蛋白质检测芯片
芯片表面化学成分不同
化学表面芯片
①疏水②亲水③弱阳离子交换④强阴离子交换⑤特异结合等。
生物表面芯片
①抗体-抗原②受体配体③DNA-蛋白质芯片等。
载体不同
①普通玻璃载体芯片②多孔凝胶覆盖芯片③微孔芯片。
特点
优点
快速、定量分析大量蛋白质
使用简单，结果正确率较高，只需少量标品，检测水平已达ng级
灵敏度高，准确性好
所需试剂少，便于诊断，实用性强
在基因组和蛋白质组水平将DNA序列信息与蛋白质产物直接联系起来
不足
稳定性较差及操作复杂等
生物芯片与传统分析相比较
生物芯片可以大量同时平行分析样品
可进行大规模的高效筛选，样品和试剂的用量小
生物芯片与酵母双杂交系统相比
生物芯片可以对整个蛋白质组的互相分析，进行全局性分析
研究进展
蛋白质探针的制备
蛋白质抗原的获得
抗原的获得方法①直接从天然组织中分离纯化蛋白分子②利用分子克隆技术在原核及真核表达系统中进行表达。
常用的表达系统①以大肠杆菌为主的原核表达系统②杆状病毒表达系统③酵母表达系统。
体外蛋白表达技术发展的两个特征:高通量化和无细胞化。
蛋白质抗体的获得
检测抗原的蛋白芯片是单克隆抗体、抗体Fab片段。
当前捕获分子的制备仍是制约蛋白芯片发展的瓶颈。
蛋白质芯片载体的类型及选择
常用的基片类型主要是二维基片和较新的多维基片。
增高结合表面积的三维芯片或四维芯片成为科学家关注的焦点。
点样方式的选择
固定方式的类型
蛋白质芯片的点样方式均是采用合成后转移到载体上的方式。分为接触式和非接触式。
蛋白活性的保持
不同类型的蛋白质，点样缓冲系统的化学成分，载体和蛋白间的结合方式也是活性的重要影响因素。
面临的重大挑战之一就是如何最大限度地保持捕获分子的活性。
反应条件的优化
反应条件的优化就是最大限度地降低背景，保证捕获分子和目的蛋白的特异反应有最佳进行环境。
信号检测方式
检测方式的发展，由荧光检测体系向非荧光标记检测技术发展。
检测方式的选择及数据处理。目前常用的是原理简单的荧光标记检测系统，一般将荧光标记分为直接式和间接式。在数据处理方面，如何区分假阳性信号和阳性弱信号有待解决。
酵母双杂交技术
酵母双杂交技术
简介
酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法，以其简便、灵敏、高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点在基因功能的研究中得到广泛的应用
原理
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并同表达于同一个酵母细胞，形成完整的转录激活因子并激活相信的报告基因表达。
例子：酵母转录因子GAL4
BD
识别上游激活序列并与之结合
AD
启动USA下游的基因进行转录
酵母双杂交的组成
诱饵蛋白
被BD融合的蛋白表达载体表达的蛋白
靶蛋白
被AD融合蛋白的蛋白表达载体表达的蛋白
一个或多个报告基因的宿主菌株
酵母双杂交系统
优点
易于转化，便于回收扩增质粒
具有可以直接进行性选择的标记基团和特征性报告基因
酵母内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合
能在体内测定蛋白质结合的作用，具有高度敏感性
原因
采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达
多次洗涤降低了信号强度
三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定
通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大
应用
鉴定两种已知蛋白之间有无相互作用
鉴定已知明确有相互作用蛋白质发生作用所必需的结构域及特定氨基酸的改变对相互作用的影响
寻找与某一特定蛋白质有相互作用的蛋白质
蛋白质相互作用图谱的绘制
应用的优势
整个过程只对核酸进行操作，实验简单易行
可以从直接从基因文库中寻找编码相互作用蛋白的DNA序列，而不需要分离纯化蛋白
可以研究蛋白之间的弱相相互作用
可以一定程度上代表细胞的真实情况
酵母双杂交体系的局限性
报告基因的转录发生在细胞核内
有一些蛋白不适用于该体系
假阳性
假阴性
吞噬体展示技术
原理
将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。
噬菌体展示系统分类
单链丝状噬菌体展示系统
PⅢ展示系统
丝状噬菌体是单链DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有3个～5个拷贝PⅢ蛋白，其在结构上可分为N1、N2和CT 3个功能区域，这3个功能区域由两段富含甘氨酸的连接肽G1和G2连接。其中，N1和N2与噬菌体吸附大肠埃希菌菌毛及穿透细胞膜有关，而CT构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分，并将整个PⅢ蛋白的C端结构域锚定于噬菌体的一端。PⅢ有2个位点可供外源序列插入，当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的信号肽(SgⅢ)和N1之间时，该系统保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌体仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的CT结构域相连，则噬菌体丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有辅助噬菌体超感染时，可以使每个噬菌体平均展示不到一个融合蛋白，即所谓“单价”噬菌体。
PⅧ及其他展示系统
PⅧ是丝状噬菌体的主要外壳蛋白，位于噬菌体外侧，C端与DNA结合，N端伸出噬菌体外，每个病毒颗粒有2 700个左右PⅧ拷贝。PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更长的肽链，因为较大的多肽或蛋白会造成空间障碍，影响噬菌体装配，使其失去感染力。但有辅助噬菌体参与时，可提供野生型PⅧ蛋白，降低价数，此时可融合多肽甚至抗体片段。 此外，尚有丝状噬菌体PⅥ展示系统的研究报道。PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌体表面，可以作为外源蛋白的融合位点，可以用于研究外源蛋白C端结构区域功能。该系统主要用于cDNA表面展示文库的构建，并取得了不错的筛选效果。
λ噬菌体展示系统
PV展示系统
λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分，该管状结构由32个盘状结构组成，每个盘又由6个PV亚基组成。PV有两个折叠区域，C端的折叠结构域（非功能区）可供外源序列插入或替换。用PV系统已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶（465 ku）和植物外源凝血素BPA（120 ku）等[13]。λ噬菌体的装配在细胞内进行，故可以展示难以分泌的肽或蛋白质。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体，这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。
D蛋白展示系统
D蛋白的分子质量为11 ku，参与野生型λ噬菌体头部的装配。低温电镜分析表明，D蛋白以三聚体的形式突出在壳粒表面。当突变型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时，可以在缺少D蛋白的情况下完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载体，而且展示的外源多肽在空间上是可以接近的。病毒颗粒的组装可以在体内也可以在体外，体外组装即是将D融合蛋白结合到λD-噬菌体表面，而体内组装是将含D融合基因的质粒转化入λD-溶源的大肠埃希菌菌种中，从而补偿溶源菌所缺的D蛋白，通过热诱导而组装。该系统有一个很好的特点，噬菌体上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，这对于展示那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有用。
T₄噬菌体展示系统
T4噬菌体展示系统的显著特点是能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白SOC（9 ku）和HOC（40 ku）融合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失。T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分泌途径，因而可展示各种大小的多肽或蛋白质，很少受到限制。吴健敏等成功地将大小约215 aa SOC/m E2融合蛋白展示于T4噬菌体衣壳表面。令人值得关注的是，SOC与HOC蛋白的存在与否，并不影响T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌体组装时可优于DNA的包装而装配于衣壳的表面，事实上，在DNA包装被抑制时，T4是双股DNA噬菌体中能够在体内产生空衣壳的噬菌体（SOC和HOC也同时组装）。因此，在用重组T4做疫苗时，它能在空衣壳表面展示目的抗原，这种缺乏DNA的空衣壳苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景。
噬菌体展示技术的局限性
（1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。常用的噬菌体展示文库中含有不同序列分子的数量一般限制在10⁹。
（2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。真核细胞蛋白在细菌中表达差是因为它们的蛋白质合成与折叠机制不同的缘故。
（3）噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。
（4）由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。
噬菌体展示肽库的筛选方法
噬菌体展示系统的建立
1985年，Smith 第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。该技术的主要特点是在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。
噬菌体展示肽库的筛选方法
生物淘金法（最常用，最早的）
选择感染性噬菌体（SIP）
延迟感染性筛选
噬菌体肽库的构建和多肽的进化
噬菌体展示技术的应用
以单克隆抗体模拟抗原表位
模拟细胞因子受体等其他分子的表位
分析蛋白质-蛋白质相互作用的界面关键点图谱
寻找大型功能蛋白的小分子模拟肽
筛选细胞和组织的特异性肽
蛋白质分子印迹技术
基本概念
利用分子印迹聚合物(MIPs）模拟酶-底物或抗体-抗原之间的相互作用，对印迹分子（也称模板分子）进行专一识别的技术。 通俗地讲, 即定制具有特异性识别“钥匙(模 板)”的能力的“人工锁”的技术
原理
①在适当的截止中，具有适当功能基的功能单体通过与模拟分子间的相互作用聚集在模板分子周围，形成单位—模板分子复合物
②加入交联剂，通过引发剂引发进行光或热聚合，使功能单体与过量的交联剂在致孔剂的存在下形成聚合物，从而使功能单体上的功能基在特定的空间取向上固定下来。
③通过一定的物理或化学方法把模板分子脱除。在聚合物中留下一个与模板分子在空间结构上完全匹配，并含有与模板分子特异性结合的功能基的三维空穴。该三维空穴可以选择性地重新与模板结合，即对模板分子具有专一性识别作用。
分类
预组织法(共价法)
原理：模板分子(印迹分子)首先通过可逆共价键与单体结合形成单体模板分子复合物，然后交联聚合，聚合后再通过化学途径将共价键断裂而去除印迹分子。
共价键作用
功能单位：含乙烯基的硼酸、醛、胺、酚、醇、
自组装法(非共价法)
原理：模板分子(或称印迹分子)与功能单位之间自组织排列，以非共价键自发形成具有多重作用位点的单体模板分子复合物，经交联聚合后保存下来。
非共价作用力
氢键、静电力、金属螯合作用、电荷转移、疏水作用、范德华力
使用一种作用制得的分子印迹聚合物选择性较低，多种作用相互结合制得的分子聚合物有较高的选择性和分离能力。
功能单位：丙烯酸、甲基丙烯酸、三氟甲基丙烯酸、亚甲基丁二酸、4-乙烯基苯甲酸、 苯乙酸、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸、N-丙烯酰基丙
聚合物研究现状
在临床药物方面：手性分离与分析，血清中药物水平的测定、抗体和受体模拟物
在化学模拟酶催化方面：化学模拟酶催化与天然生物酶催化剂相比，具有抗恶劣环境的能力，表现出高度稳定性和较长使用寿命
膜分离和固相萃取
膜分离：MIPs对目标分子具有特异性吸附和良好的机械强度。Piletsky等采用原位聚合法首次制备了MIPS膜，实现了对模板分子腺苷酸的特异识别和分离。
色谱分离：用分子印迹聚合物作为色谱分离的固定相，以建立固相萃取、高效液相色谱或毛细管电冰分析法进行手性物质的分离，也用于样品的预处理。
展望
分子印迹技术具有较高的选择性、灵敏度和稳定性，在分离、化学和生物传感及模拟酶催化等许多领域具有重要的应用前景