柱层析使用方法及注意事项

柱层析技术又称柱色谱技术，主要原理是根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离开来。

柱层析使用方法

• 柱层析分离原理
  • 根据物质在硅胶柱上的吸附力不同而使各组分分离
  • 极性较大的物质易被硅胶吸附，不易被溶剂洗脱，后出柱。
  • 极性较弱的物质不易被硅胶吸附，较易被溶剂洗脱，先出柱。
  • 当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程。
• 装柱
  • 湿法装柱
    • 硅胶用适当的溶剂搅拌均匀，填入柱子中
    • 加入淋洗剂，加压走柱子。淋洗剂是采用TLC分析得到展开剂的比例再稀释一倍
    • 优点装的比较结实，没有气泡
  • 干法装柱
    • 硅胶填装
      • 直接往柱子里填硅胶
      • 轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止
      • 再填入硅胶至合适高度，最后用油泵抽
      • 装完的柱子应该适度紧密（太密了淋洗剂走的慢），一定要均匀，不能出现裂缝
    • 加入淋洗剂，加压走柱子
      • 淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂
      • 加入淋洗剂，上面加压，下面可用油泵抽，加快速度
      • 容易产生气泡
        • 加压时气泡不明显，一旦撤去压力，气泡就会立即释放出来，严重时柱子变花
        • 低沸点的淋洗剂如乙醚，二氯甲烷更为明显
        • 硅胶一定要填结实，
        • 用较多的溶剂走柱子，一定要到柱子下端不再发烫，恢复室温再撤压力
        • 在硅胶上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂时，使样品层不再整齐
  • 硅胶用量
    • 柱子的径高比一般在1:5~1:10
    • 一般每分离1g产品使用30~100g硅胶
    • 所需组分和杂质分的比较开（组分rf在0.2~0.4，杂质相差0.1以上），可以少用硅胶，用小柱子
    • 如果Rf相差不到0.1，就要用大柱子，多用硅胶
  • 迁移率Rf值
    • 相对迁移率（Rf）来表示一种物质的迁移
    • Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离=原点至组分斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离
• 上样
  • 干法上样
    • 待分离样品用少量溶剂溶解，加入少量硅胶，拌匀后旋干溶剂，得到的粉末小心加入
    • 比较麻烦，但可以保证样品层很平整
  • 湿法上样
    • 待分离样品用少量溶剂溶解（最好是展开剂，如果展开剂溶解度不好，则可以用极性大的溶剂，但必须是少量
    • 用胶头滴管将溶解后的溶液沿层析柱内壁均匀加入
    • 再用少量溶剂洗涤容器后，再加入
    • 上样后，加一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面，然后就可以大量加入洗脱剂而不会冲坏硅胶表面
    • 湿法上样要避免添加样品溶液速度过快破坏上层硅胶的平整（最好在硅胶顶端加一层石英砂）
• 过柱
  • 洗脱剂选择
    • 采用TLC来进行筛选
    • 一般TLC展开时，Rf值为0.2~0.3的展开剂为最佳洗脱溶剂
    • 洗脱剂是TLC得到的展开剂的比例再稀释一倍的溶剂
    • 为节省洗脱溶剂，一般采用梯度洗脱法洗脱
    • 对在硅胶（酸性物质）上易分解的物质
      • 在洗脱剂中加一点点三乙胺，氨水，吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性
      • 选择所添加的碱性物质，必须考虑容易从产品中除去，氨水无疑是最好的选择
  • 展开剂选择
    • 使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果
    • 混合溶剂
      • 通常使用一个高极性和一个低极性溶剂组成的混合溶剂
      • 展开剂比例要靠尝试，优先尝试文献报道中的展开剂，根据效果不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的
      • 常用溶剂按照极性从小到大：石油醚，己烷，笨，乙醚，四氟氢喃，乙酸乙酯，丙酮，乙醇，甲醇
      • 常用的展开剂组合：石油醚/乙酸乙酯，石油醚/丙酮，石油醚/二氯甲烷，二氯甲烷/乙酸乙酯，乙酸乙酯/甲醇，三氯甲烷/乙酸乙酯
      • 两种溶剂混合时，采用高极性/低极性的体积比为3:1，如果有分开的迹象，再调整比例，达到最佳效果，如果没有分开，最好换溶剂
      • 常用的混合溶剂系统（根据目标产物的极性）
        • 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统
        • 极性较大的用甲醇：氯仿系统
        • 极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统
        • 拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸（产品中含有羧基集团容易拖尾）
• 分离收集
  • 影响分离效果因素
    • 洗脱剂的比例（主要因素）
    • 硅胶的质量：含水量，颗粒度，酸性强弱。鉴于此，硅胶不用时一定要密封，防止吸潮；TLC使用的硅胶板一定要保存在干燥器中或使用红外烘箱干燥
    • 洗脱溶剂的质量：含水量和杂质的含量对分离效果有明显的影响
    • 环境温度：分离相同的产品，所需淋洗剂的极性，夏天比冬天小的多，故分离时最好保持稳定的环境温度
  • TCL点板追踪分离进度和效果
    • 点不能点的太浓，容易重叠，不易判断。如果两个点相近的话，一浓就变成一个点
    • 板上点的清晰度和溶剂的极性和物质在该溶剂的溶解性有关，只有两者比较合适，才能达到好的分离效果。
    • 检测最好使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多的产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂低1~2个数量级。
  • 等分收集洗脱液
    • 每份收集量大概与所用硅胶的量相当
    • 每份洗脱液采用TLC定性检查，合并含相同成分的洗脱液
    • 浓缩、重结晶处理往往可得到某单一成分